葡萄籽原花青素對(duì)缺血再灌注肝臟氧化損傷和細(xì)胞凋亡的影響

劉仁貴，張自華，秦 燕，蘇 娟，楊繼武

（1.大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

葡萄籽原花青素對(duì)缺血再灌注肝臟氧化損傷和細(xì)胞凋亡的影響

劉仁貴1，張自華1，秦 燕2，蘇 娟2，楊繼武1

（1.大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

目的：探討葡萄籽原花青素對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷的抗氧化作用、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。方法：SD雄性大鼠30只，復(fù)制肝缺血再灌注損傷模型。隨機(jī)分為：假手術(shù)組；HIRI模型組；葡萄籽原花青素預(yù)處理（GSPE）組（160 mg∕kg），每組10只。于再灌注后3 h檢測(cè)肝組織谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量及血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）的含量；光鏡下比較各組肝組織形態(tài)學(xué)的變化；免疫組化法檢測(cè)GSPE對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Bax表達(dá)的影響。結(jié)果：與HIRI模型組比較，GSPE預(yù)處理組血清ALT、AST水平明顯降低（P＜0.05）；肝組織GSH-Px、SOD的活性明顯升高（P＜0.05），而MDA含量下降（P＜0.05）。光鏡下GSPE預(yù)處理組肝細(xì)胞損傷程度較模型組明顯減輕；免疫組化結(jié)果顯示，GSPE預(yù)處理組肝組織Bcl-2蛋白的表達(dá)量較模型組明顯增多，而Bax蛋白的表達(dá)量則較模型組明顯減少。結(jié)論：GSPE對(duì)缺血再灌注肝臟具有一定的抗氧化損傷和抗凋亡的作用。

葡萄籽原花青素；缺血再灌注；肝臟；氧化損傷；Bcl-2，Bax蛋白

肝缺血再灌注損傷（hepatic ischemia reperfu?sion injury，HIRI）指各種原因?qū)е赂窝髦袛嗷虿蛔闶垢闻K缺血，當(dāng)恢復(fù)血供再灌注后，肝細(xì)胞功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)破壞反而加重。HIRI在肝移植、休克復(fù)蘇、嚴(yán)重肝外傷及肝葉切除等過(guò)程中均不可避免，是影響上述疾病治療效果和預(yù)后的重要原因之一。因此，如何減輕缺血再灌注肝的損傷是目前肝臟外科特別是肝移植外科的研究熱點(diǎn)。但HIRI的機(jī)制至今尚未完全闡明，與氧源性自由基的產(chǎn)生、肝細(xì)胞凋亡、中性粒細(xì)胞的聚集、炎性因子釋放等因素都有密切關(guān)系。其中氧自由基生成增多及機(jī)體抗氧化能力減弱所引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)是肝細(xì)胞缺血再灌注損傷發(fā)生的重要原因〔1-2〕。

葡萄籽原花青素（grape seed pro-anthocyanidin extract，GSPE）是從葡萄籽中提取出來(lái)的一類多酚化合物，研究表明GSPE是一種很好的自由基清除劑、脂質(zhì)過(guò)氧化抑制劑及抗氧化劑〔3-5〕。體外實(shí)驗(yàn)顯示，GSPE還具有較強(qiáng)的抗細(xì)胞凋亡的作用〔6〕。故本研究通過(guò)建立大鼠缺血再灌注肝損傷模型，探討GSPE對(duì)缺血再灌注肝臟氧化損傷和抗凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1試劑谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、考馬斯亮蘭檢測(cè)試劑盒，以上試劑均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Bcl-2，Bax抗體，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；GSPE，購(gòu)自西安小草植物科技有限責(zé)任公司，其它試劑均為常用化學(xué)試劑。各指標(biāo)均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明由專人進(jìn)行統(tǒng)一檢測(cè)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器JY88-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝科器研究所）；18R冷凍高速離心機(jī)TGL-18R（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；電子分析天平CVA214C（奧豪斯儀器上海有限公司）；電子制冰機(jī)Barline BF320（斯科茨曼制冰系統(tǒng)上海有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥SD雄性大鼠30只，體重210～250 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)為SCXK（滇）2011-0004。適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，隨機(jī)分為3組，每組10只：假手術(shù)組、肝缺血再灌注損傷模型組及GSPE預(yù)處理組。GSPE預(yù)處理組于術(shù)前3周連續(xù)給予2%GSPE水溶液（160 mg∕kg）3 mL灌胃，每天1次，而假手術(shù)組和模型組給予同體積的生理鹽水灌胃。

1.4動(dòng)物模型的制備實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水，10%水合氯醛麻醉大鼠（4 mL∕kg）腹腔注射，麻醉顯效后腹部消毒，腹部正中切口打開腹腔，暴露肝門，分離出門靜脈及肝動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉肝左、中葉的入肝血管，阻斷入肝血流，制作70%的肝缺血模型，缺血45 min后再灌注3 h，制備大鼠HIRI模型〔1〕，缺血及再灌注期間均暫時(shí)關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組暴露肝門后，僅分離出門脈及肝動(dòng)脈，不夾閉。于再灌注3 h后自下腔靜脈取血及取肝臟組織。

1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 血清ALT、AST含量的測(cè)定 再灌注3 h后自下腔靜脈取血3 mL，3 500 r∕min，離心10 min，保留血清備用。血清ALT、AST含量由全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.5.2 肝組織GSH-Px，SOD，MDA含量的檢測(cè) 切取同一部分肝組織用濾紙擦干，稱重0.5 g，置于1∶9冰生理鹽水中，用勻漿器充分碾碎肝組織制成10%勻漿，4℃離心（6 500 r∕min，15 min），保留上清液。分別在412 nm、630 nm及532 nm波長(zhǎng)處測(cè)定肝勻漿中GSH-Px、SOD、MDA的含量。

1.5.3 肝組織HE染色 取另一部分肝組織置于4%多聚甲醛中，固定后制成石蠟切片，HE染色后置于光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.5.4 肝組織Bcl-2，Bax蛋白檢測(cè) 用免疫組化SP法，按試劑盒說(shuō)明書操作，200倍光鏡，胞漿棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)輸入SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSPE對(duì)肝缺血再灌注大鼠血清ALT、AST含量的影響與假手術(shù)組比較，I∕R組、GSPE預(yù)處理組大鼠血清ALT及AST水平明顯升高（P＜0.05）；與I∕R組比較，GSPE預(yù)處理組大鼠血清ALT及AST水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1各組大鼠血清ALT、AST含量的變化（，n=10）

表1各組大鼠血清ALT、AST含量的變化（，n=10）

注：與假手術(shù)組相比▲P＜0.05，與I∕R組比較●P＜0.05。

組別假手術(shù)組I∕R組GSEP預(yù)處理組AST∕（U∕L）52.67±18.56 167.00±13.52▲79.38±15.20▲●ALT∕（U∕L）40.29±9.84 198.03±29.41▲93.46±19.43▲●

2.2 GSPE對(duì)肝缺血再灌注大鼠GSH-Px，SOD，MDA含量的影響與假手術(shù)組比較，IR組、GSPE預(yù)處理大鼠肝組織GSH-Px、SOD活性明顯降低（P＜0.05），而MDA的含量升高；與I∕R組比較，GSPE預(yù)處理組大鼠肝組織GSH-Px、SOD活性明顯升高，同時(shí)MDA的含量降低（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肝組織GSH-Px、SOD及MDA含量的變化（，n=10）

表2 各組大鼠肝組織GSH-Px、SOD及MDA含量的變化（，n=10）

注：與假手術(shù)組相比▲P＜0.05，與I∕R組比較●P＜0.05。

組別假手術(shù)組I∕R組GSEP預(yù)處理組MDA∕(nmol∕mg) 3.78±0.69 10.12±1.96▲8.03±1.11▲●GSH-Px∕（μmol∕L）296.12±26.10 123.81±15.46▲198.12±16.31▲●SOD∕(U∕mgprot) 223.00±16.58 97.45±11.56▲147.80±13.01▲●

2.3光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化假手術(shù)組偶見(jiàn)少部分肝細(xì)胞體積增大；HIRI模型組肝細(xì)胞體積普遍明顯增大，胞漿疏松淡染，部分可見(jiàn)空泡變性及溶解壞死，血竇變窄、扭曲，充血；GSPE預(yù)處理組：經(jīng)GSPE預(yù)處理后，與HIRI模型組比較，僅見(jiàn)少部分肝細(xì)胞輕度增大。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的變化（HE，×400）

2.4肝組織Bcl-2，Bax蛋白表達(dá)的變化HIRI模型組Bax蛋白的表達(dá)量明顯增強(qiáng)，GSPE預(yù)處理組Bax蛋白的表達(dá)僅分布于壞死灶周圍及匯管區(qū)；HIRI模型組Bcl-2蛋白的表達(dá)量明顯減少，而GSPE預(yù)處理組后，Bcl-2蛋白的表達(dá)量明顯增強(qiáng)。見(jiàn)圖2-3。

圖2 各組大鼠肝組織Bax蛋白免疫組化染色結(jié)果（DAB，×200）

圖3 各組大鼠肝組織Bcl-2蛋白免疫組化染色結(jié)果（DAB，×200）

3 討論

HIRI在肝移植、休克復(fù)蘇、嚴(yán)重肝外傷、肝門阻斷及肝葉切除等過(guò)程中均不可避免，是影響上述疾病治療效果和預(yù)后的重要原因之一。因此，如何減輕缺血再灌注肝的損傷是目前肝臟外科特別是肝移植外科的研究熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外防治HIRI多采用針對(duì)某一損傷途徑的拮抗劑，如抗氧化劑、抗凋亡藥物、黏附分子拮抗劑和選擇素拮抗劑等。這些藥物雖然有一定的療效，但是難以達(dá)到理想的保護(hù)治療效果，有些甚至有較大的副作用，因此尋求一種安全、高效、低廉的藥物一直是HIRI研究者努力的方向。

Yamaguchi等應(yīng)用ESR分光術(shù)發(fā)現(xiàn)GSPE除了能清除超氧自由基及羥基自由基外，尚有清除甲基自由基的作用〔7〕。Roychowdnury等發(fā)現(xiàn)應(yīng)用GSPE預(yù)處理大鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞可增加細(xì)胞內(nèi)低水平的NO產(chǎn)量，保護(hù)內(nèi)源性谷胱甘肽池，使星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)氫過(guò)氧化物的耐受性增加，提示除其本身的直接抗氧化作用外，還可通過(guò)保護(hù)內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)而起到抗氧化損傷作用〔8〕。說(shuō)明GSPE是一種很好的自由基清除劑、脂質(zhì)過(guò)氧化抑制劑及抗氧化劑。另有研究提示GSPE在減輕兔MRI的同時(shí)，對(duì)其引起的細(xì)胞凋亡有明顯的保護(hù)作用，說(shuō)明GSPE抗氧化損傷的同時(shí)還能抗細(xì)胞凋亡〔9〕。

本課題研究結(jié)果顯示，I∕R組血清ALT、AST的水平明顯高于假手術(shù)組，說(shuō)明缺血再灌注時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)等因素引起肝細(xì)胞發(fā)生損傷，膜通透性增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外漏。給予GSPE預(yù)處理后，血清ALT及AST的水平均明顯降低，低于I∕R組（P＜0.05），提示GSPE對(duì)穩(wěn)定肝細(xì)胞膜可能具有一定的作用。肝組織GSH-Px及SOD活性，MDA含量檢測(cè)也顯示：GSPE預(yù)處理組GSH-Px及SOD活性明顯升高，高于I∕R組，與此同時(shí)MDA含量則明顯低于I∕R組（P＜0.05），差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，GSPE清除氧自由基、減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，有效減輕了缺血再灌注引起的氧化損傷。肝組織病理改變顯示：GSPE預(yù)處理組的肝損傷程度較模型組明顯減輕，與上述結(jié)果一致。

近年來(lái)大量研究資料表明，HIRI時(shí)細(xì)胞死亡的方式可通過(guò)凋亡和壞死兩條途徑。HIRI發(fā)生時(shí)有多種基因參與了細(xì)胞凋亡的調(diào)控，如Bcl-2家族、Caspase家族、TNF受體家族等，其中Bcl-2是最重要的抗凋亡基因。Bax可與Bcl-2蛋白通過(guò)形成同源或異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，加強(qiáng)表達(dá)Bax蛋白形成同源二聚體將加速細(xì)胞凋亡。免疫組化的結(jié)果顯示，與I∕R組比較，GSPE預(yù)處理組抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯增加，而凋亡蛋白Bax的表達(dá)則明顯減少，說(shuō)明GSPE具有對(duì)抗細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，GSPE對(duì)缺血再灌注損傷的肝臟具有一定的抗氧化損傷和抗凋亡的作用，從而為HIRI的防治提供了新的思路。

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（責(zé)任編輯 李 楊）

Effects of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Hepatic Ischemia Reperfusion Oxidative Injury and Apoptosis

LIU Rengui1,ZHANG Zihua1,QIN Yan2,SU Juan2，YANG Jiwu1
（1.Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan671000,China;2.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan671000,China）

Objective:To study the effects of grape seed proanthocyanidin extract（GSPE）on antioxidation of hepatic ischemia reperfusion injury in rats,and the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax.Methods:Thirty SD male rats were randomly divided into three groups with 10 rats each.i.e.sham operation group,HIRI model group and GSPE preconditioning group（160 mg∕kg）.The content of GSH-Px,SOD,and MDA in hepatic tissues,and the content of ALT and AST in serum were assayed 3 hours later after reperfusion.The morphological variations of hepatic tissues in each group were compared by means of optical microscope.Effects of GSPE on Bcl-2 and Bax in hepatic tissues were tested by means of immunohistochemisty.Results:The content of ALT and AST in serum and MDA in hepatic tissues decreased significantly（P＜0.05）,and the content of GSH-Px and SOD in hepatic tissues increased remarkably（P＜0.05）in GSPE preconditioning group,compared with HIRI model;Observed by the optical microscope,the degree of liver cell injury in GSPE preconditioning group was remarkably slighter than that of HIRI model group. Immunohistochemical results showed that the content of Bcl-2 increased and Bax decreased significantly in hepatic tissues,compared with that in HIRI model（P＜0.05）.Conclusion:GSPE had some effects on antioxidation and anti-apoptosis of hepatic ischemia reperfusion injury.

GSPE;ischemia reperfusion;liver;oxidative injuries;proteins Bcl-2 and Bax

R657.3

A

1672-2345（2014）08-0011-04

10.3969∕j.issn.1672-2345.2014.08.004

云南省教育廳基金資助項(xiàng)目（0900158）

2014-02-20

2014-05-04

劉仁貴，副主任醫(yī)師，主要從事普外基礎(chǔ)與臨床工作研究.