底物對凝結芽孢桿菌TQ33產苯乳酸的影響

王海寬，高雪芹，張淑麗，周超

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

底物對凝結芽孢桿菌TQ33產苯乳酸的影響

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

苯乳酸是一種具有廣泛抑菌活性的化合物，它可以由許多微生物產生，尤其是乳酸菌．凝結芽孢桿菌TQ33是一株能夠產生苯乳酸的微生物．將凝結芽孢桿菌TQ33在發(fā)酵液中培養(yǎng)72,h后，發(fā)酵上清液中苯乳酸的質量濃度達到了(51.7±1.0) mg/L．為了提高苯乳酸產量，將苯丙酮酸加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，結果證明凝結芽孢桿菌TQ33能夠有效地將苯丙酮酸轉化為苯乳酸，從而獲得高濃度的苯乳酸，最高質量濃度為(726.1±3.0) mg/L．苯丙酮酸的添加使苯乳酸的產量提高了13倍，發(fā)酵時間由原來的72,h縮短到24,h．旋光性實驗證明凝結芽孢桿菌TQ33產生的苯乳酸為L–苯乳酸．

凝結芽孢桿菌TQ33；苯乳酸；苯丙酮酸

苯乳酸在高溫和低pH下具有很好的穩(wěn)定性，它是一種旋光性化合物，具有兩種手性結構：L–苯乳酸和D–苯乳酸．除了奶酪和蜂蜜以外[1-2]，在許多微生物的代謝產物中也能夠找到苯乳酸．苯乳酸的安全性和抗細菌[3]、真菌活性，使苯乳酸作為防腐劑在食品和飼料中具有很大的應用潛能．

目前，有化學和生物合成這兩條途徑可以合成苯乳酸．研究[4]表明在苯丙氨酸生成苯乳酸的過程中，苯丙氨酸首先由轉氨酶催化生成苯丙酮酸，進一步被脫氫酶催化生成苯乳酸．與化學合成相比，生物合成苯乳酸更安全、環(huán)保．近幾年，微生物尤其是乳酸菌合成苯乳酸引起人們的廣泛關注．有研究表明，多數(shù)的乳酸菌例如植物乳桿菌、希氏乳桿菌、檸檬明串珠菌都可以利用MRS培養(yǎng)基發(fā)酵獲得苯乳酸，這些乳酸菌產生的苯乳酸的產量在0.16～0.46,mmol/L[5].對許多乳酸菌來說，轉氨反應對苯乳酸的合成是限速反應，因此目前苯丙酮酸被認為是合成苯乳酸最適合的底物[6]．另外，戊糖片球菌[7]、白地霉[8]也能有效地

將苯丙氨酸和苯丙酮酸轉化為D–苯乳酸．丙酸菌[9]也可以產生0.01～0.1,mmol/L的苯乳酸．

凝結芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌，可以在廣泛的溫度和pH環(huán)境中生長[10]．另外，凝結芽孢桿菌還可以在胃液、膽汁中存活，并且能夠黏附在人腸壁上皮細胞上，有利于調節(jié)腸道菌群和免疫應答[11]．由于易于培養(yǎng)和保存，凝結芽孢桿菌作為益生菌有很大的優(yōu)勢．但是，凝結芽孢桿菌產苯乳酸的研究[12]比較少.本文比較了凝結芽孢桿菌TQ33與其他3株凝結芽孢桿菌產苯乳酸的產量，研究凝結芽孢桿菌TQ33產苯乳酸的能力，并且通過底物的添加來提高凝結芽孢桿菌TQ33產苯乳酸的能力．另外，通過分離收集發(fā)酵液中的苯乳酸，利用全自動旋光儀確定了凝結芽孢桿菌TQ33產生的苯乳酸的旋光性．

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

凝結芽孢桿菌TQ33，取自天津科技大學酶與應用微生物實驗室．凝結芽孢桿菌1.949、1.2407和1.2009購買于中國微生物菌種保存中心．

苯乳酸、苯丙酮酸、苯丙氨酸，分析純，Sigma公司；乙腈，色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司；其他試劑材料為市售．

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母膏3.0、葡萄糖5.0、瓊脂20.0，pH 7.2～7.4．

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20.0、酵母膏10.0、葡萄糖20.0，初始pH 7.2～7.4．

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0、酵母膏10.0、葡萄糖6.0、硫酸鎂1.0、磷酸氫二鉀2.0，初始pH 7.2～7.4．

1.2.2 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)條件：取斜面種子，用接種環(huán)挑取兩環(huán)菌苔接入裝有50,mL種子培養(yǎng)基的250,mL三角瓶中，37,℃、180,r/min振蕩培養(yǎng)18,h．

發(fā)酵條件：按照體積比以5%的接種量將種子液接入裝有100,mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500,mL三角瓶中．每個樣品3個平行，37,℃、180,r/min培養(yǎng)一定時間．

1.3 發(fā)酵液中苯乳酸、苯丙酮酸和苯丙氨酸的檢測方法

取發(fā)酵一定時間后的發(fā)酵液2,mL于離心管中，10,000,r/min離心5,min，吸取上清液，過膜(0.22,μm).濾液進行高效液相色譜分析，3種成分的色譜分析條件如下．

苯乳酸檢測的液相條件：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱，流動相為體積比90∶10的1,mmol/L H2SO4與乙腈的混合液，進樣量為10,μL，流量為0.7,mL/ min，柱溫為30,℃，檢測波長210,nm．

苯丙酮酸檢測的液相條件：Agilent Zorbax SBC18色譜柱，流動相為體積比93∶7的1,mmol/L H2SO4與乙腈的混合液，進樣量為10,μL，流量為0.4,mL/min，柱溫為30,℃，檢測波長210,nm．

苯丙氨酸檢測的液相條件：Agilent Zorbax SBC18色譜柱，流動相為體積比95∶5的1,mmol/L H2SO4與乙腈的混合液，進樣量為10,μL，流量為0.2,mL/min，柱溫為30,℃，檢測波長210,nm．

1.4 實驗方法

1.4.1 不同凝結芽孢桿菌的苯乳酸產量測定

分別挑取凝結芽孢桿菌TQ33和其他3株凝結芽孢桿菌，接入種子培養(yǎng)基中；37,℃、180,r/min培養(yǎng)18,h；培養(yǎng)完成后將這4株菌的種子液以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,每株菌3個平行，37,℃、180,r/min培養(yǎng)；72,h后離心發(fā)酵液，檢測不同菌株苯乳酸產量．

1.4.2 凝結芽孢桿菌TQ33生長曲線及不同發(fā)酵時間苯乳酸產量測定

采用分光光度計分別檢測凝結芽孢桿菌TQ33培養(yǎng)0、2、4、6、12、24、48、72、96,h時樣品的A600，高效液相色譜法檢測相應時間苯乳酸的產量．

1.4.3 苯丙氨酸添加量對凝結芽孢桿菌TQ33合成苯乳酸的影響

控制發(fā)酵培養(yǎng)基中苯丙氨酸的添加量為0.2、0.4、0.5、1.0、2.0、3.0,g/L，滅菌后接入凝結芽孢桿菌TQ33發(fā)酵72,h后，取樣檢測苯乳酸的產量．

1.4.4 苯丙氨酸對發(fā)酵過程中苯乳酸和苯丙酮酸生成的影響

添加苯丙氨酸(添加量0.5,g/L)的發(fā)酵培養(yǎng)基經過滅菌后接入凝結芽孢桿菌TQ33，37,℃、180,r/min培養(yǎng)．分別在0、2、4、6、12、24、48、72,h取樣，檢測相應時間發(fā)酵液中的苯乳酸、苯丙酮酸和苯丙氨酸含量．

1.4.5 苯丙酮酸添加量對凝結芽孢桿菌TQ33合成苯乳酸的影響

控制發(fā)酵培養(yǎng)基中苯丙酮酸的添加量分別為

0.5、1.0、2.0、3.0,g/L，發(fā)酵72,h檢測苯乳酸的含量．

1.4.6 苯丙酮酸對發(fā)酵過程中苯乳酸合成的影響

控制發(fā)酵液中苯丙酮酸的添加量為2.0,g/L，凝結芽孢桿菌TQ33發(fā)酵液培養(yǎng)過程中，分別在0、2、4、6、12、24、48、72,h取樣，檢測對應時間的發(fā)酵液中苯乳酸和苯丙酮酸含量．

1.4.7 凝結芽孢桿菌TQ33產生的苯乳酸旋光性的確定

通過制備液相色譜分離純化發(fā)酵液中的苯乳酸．實驗使用的是安捷倫1200液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為PrepHI×300,SB-C18(21.2,mm×150,m)，流量10,mL/min．苯乳酸收集完后，利用WZZ–3型全自動旋光儀檢測苯乳酸的旋光性，蒸餾水作為對照，實驗重復3次．若旋光度是正值，則為D–苯乳酸，否則為L–苯乳酸[13]．

2 結果與討論

2.1 不同凝結芽孢桿菌合成苯乳酸的比較

不同凝結芽孢桿菌的苯乳酸產量如圖1所示．由圖1可以看出：凝結芽孢桿菌TQ33苯乳酸的產量最高，為(49.5±1.0)mg/L；其次為凝結芽孢桿菌1.2009，產量為(37.6±1.2)mg/L．不同菌株的苯乳酸產量相差較大，可能是不同菌株中與苯乳酸合成相關的酶活性不同，在該研究所采取的實驗條件下，凝結芽孢桿菌TQ33合成苯乳酸的酶活性可能最高．

2.2 凝結芽孢桿菌TQ33生長曲線以及不同發(fā)酵時間苯乳酸的產量

凝結芽孢桿菌TQ33生長曲線以及不同發(fā)酵時間苯乳酸的產量如圖2所示．由圖2可以看出：0～6,h內，A600變化很小，說明在這段時間內，發(fā)酵液中凝結芽孢桿菌TQ33菌體濃度變化很小，為延遲期；6～72,h內，凝結芽孢桿菌TQ33菌體濃度不斷增加，在72,h時達到最大值，這段時間為發(fā)酵的對數(shù)期；再延長培養(yǎng)時間，A600基本不變，說明72,h后菌體濃度基本不變，為穩(wěn)定期．而苯乳酸的產量在發(fā)酵2,h內就開始不斷增加，一直到72,h達到最高產量，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，苯乳酸產量下降．

2.3 苯丙氨酸添加量對苯乳酸合成的影響

苯丙氨酸對凝結芽孢桿菌TQ33苯乳酸產量的影響如圖3所示．

由圖3可以看出：隨著苯丙氨酸添加量的提高，苯乳酸的產量升高，苯丙氨酸的轉化率增加；但是苯丙氨酸的添加量超過0.5,g/L時，苯乳酸產量和苯丙氨酸的轉化率都降低，這可能是高濃度的苯丙氨酸會抑制轉氨酶的活性，從而使苯乳酸產量降低．

2.4 苯丙氨酸對發(fā)酵過程中苯乳酸和苯丙酮酸生成的影響

添加0.5,g/L苯丙氨酸時，苯乳酸和苯丙酮酸生成量的變化如圖4所示．由圖4可以看出：發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.5,g/L苯丙氨酸時，苯乳酸的產量不斷增

加，48,h以后產量變化逐漸減?。谡麄€發(fā)酵過程中，一直未檢測到苯丙酮酸，這應該是苯丙氨酸轉化為苯丙酮酸后，很快被進一步轉化生成了苯乳酸，這也說明了轉氨反應是整個反應的關鍵步驟[6]．

2.5 苯丙酮酸添加量對苯乳酸產量的影響

苯丙酮酸添加量對苯乳酸產量的影響如圖5所示．由圖5可以看出：添加了苯丙酮酸以后，苯乳酸產量明顯增大，并且隨著苯丙酮酸添加量的增加，苯乳酸產量也增加，在添加量為2,g/L時，苯乳酸的產量達到最大值，此時苯丙酮酸的轉化率最大為92.1%；苯丙酮酸的添加量繼續(xù)增加時，苯乳酸產量和苯丙酮酸轉化率都下降，這可能是高濃度的苯丙酮酸抑制了轉化過程中的酶，從而使苯乳酸產量下降．

2.6 苯丙酮酸對發(fā)酵過程中苯乳酸合成的影響

添加2.0,g/L的苯丙酮酸，發(fā)酵過程中苯乳酸和苯丙酮酸濃度的變化如圖6所示．由圖6可以看出：苯丙酮酸的含量逐漸減少，苯乳酸的產量不斷增加，24,h時苯乳酸產量達到最大值；此后苯乳酸產量變化不大，并且苯丙酮酸減少量變化也很小，這說明24,h以后，苯丙酮酸就不再轉化為苯乳酸，因此培養(yǎng)基中加入了苯丙酮酸后可以將苯乳酸的取樣時間縮短到24,h．

2.7 凝結芽孢桿菌TQ33產生的苯乳酸旋光性的確定

經檢測，凝結芽孢桿菌TQ33產生的苯乳酸旋光度為－0.52，說明凝結芽孢桿菌TQ33所產生的苯乳酸為L–苯乳酸．這與所報道的其他菌株不同，乳酸菌和丙酸菌所產生的是D–苯乳酸和L–苯乳酸的混合體，只是這兩種構象的苯乳酸比例不同[14]．另外，關于D–苯乳酸和L–苯乳酸的抗菌活性有不同的報道，D–苯乳酸比L–苯乳酸顯示出了更高的抗李斯特菌的活性[8]．

3 結 論

通過4株凝結芽孢桿菌苯乳酸產量的比較發(fā)現(xiàn)，凝結芽孢桿菌TQ33苯乳酸產量最高，說明凝結芽孢桿菌TQ33產苯乳酸能力最強．苯丙氨酸添加量為0.5,g/L時，苯乳酸產量提高到(89.9±0.7),mg/L，而添加苯丙酮酸為2,g/L時，苯乳酸的產量由原來的(51.7±1.0),mg/L，提高到(726.1±3.0),mg/L，產量提高了13倍．不同底物添加量以及苯乳酸產量的差別也表明了在苯丙氨酸生成苯乳酸的過程中，轉氨反應為限速步驟．在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入苯丙氨酸，苯乳酸最佳轉化時間可以縮短到48,h；而加入苯丙酮酸時，苯乳酸最佳獲取的時間提前到24,h，這說明底物的添加可以縮短發(fā)酵時間．苯乳酸旋光性實驗表明凝結芽孢桿菌TQ33產生的苯乳酸是L–苯乳酸．

［1］ Thierry A，Maillard M B. Production of cheese flavour compounds derived from amino acid catabolism byPropionibacterium freudenreichii[J]. Le Lait，2002，82(1)：17–32.

［2］ Wilkins A L，Lu Y, Molan P C. Extractable organic substances from New Zealand unifloral manuka(Leptospermum scoparium)honeys[J]. Journal of Apicultural Research，1993，32(1)：3–9.

［3］ Rodríguez N，Salgado J M，Max B，et al. Phenyllactic acid production by fed-batch fermentation ofLactobacillus plantarumCECT-221[J]. Journal of Biotechnology, 2010，150：320.

［4］ Lavermicocca P，Valerio F，Visconti A. Antifungal activity of phenyllactic acid against molds isolated from bakery products[J]. Applied and Environmental Microbiology，2003，69(1)：634–640.

［5］ Valerio F，Lavermicocca P，Pascale M，et al. Production of phenyllactic acid by lactic acid bacteria：An approach to the selection of strains contributing to food quality and preservation[J]. FEMS Microbiology Letters，2004，233(2)：289–295.

［6］ Li X F，Jiang B，Pan B L. Biotransformation of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by growing and resting cells of aLactobacillussp.[J]. Biotechnology Letters，2007，29(4)：593–597.

［7］ Yu S，Jiang H，Jiang B，et al. Characterization of D-lactate dehydrogenase producing D-3-phenyllactic acid fromPediococcus pentosaceus[J]. Bioscience，Biotechnology, and Biochemistry，2012，76(4)：853–855.

［8］ Dieuleveux V，Lemarinier S，Guéguen M. Antimicrobial spectrum and target site of d-3-phenyllactic acid[J]. International Journal of Food Microbiology，1998，40(3)：177–183.

［9］ Lind H，Sj?gren J，Gohil S，et al. Antifungal compounds from cultures of dairy propionibacteria type strains[J]. FEMS Microbiology Letters，2007，271(2)：310–315.

［10］ De Clerck E，Rodriguez-Diaz M，F(xiàn)orsyth G，et al. Polyphasic characterization ofBacillus coagulansstrains，illustrating heterogeneity within this species，and emended description of the species[J]. Systematic and Applied Microbiology，2004，27(1)：50–60.

［11］ Ripamonti B，Agazzi A，Baldi A，et al. Administration of Bacillus coagulans in calves：Recovery from faecal samples and evaluation of functional aspects of spores [J]. Veterinary Research Communications，2009，33(8)：991–1001.

［12］ Zheng Z J，Ma C Q，Gao C，et al. Efficient conversion of phenylpyruvic acid to phenyllactic acid by using whole cells ofBacillus coagulansSDM[J]. PloS One，2011，6(4)：e19030.

［13］ 尹玉英，劉春蘊. 乳酸及其某些衍生物的旋光性與結構的關系[J]. 北京石油化工學院學報，2002，10(1)：12–15.

［14］ Sj?gren J. Bioassay-guided isolation and characterisation of antifungal metabolites[D]. Uppsala：Swedish University of Agricultural Sciences，2005.

責任編輯：周建軍

Effect of Substrates on the Production of Phenyllactic Acid of Bacillus coagulans TQ33

WANG Haikuan，GAO Xueqin，ZHANG Shuli，ZHOU Yanchao
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Phenyllactic acid (PLA), produced by many microorganisms especially lactic acid bacteria (LAB), is an antimicrobial compound with a broad antimicrobial spectrum. Bacillus coagulansTQ33,isolated from skimmed milk powder can produce PLA. The concentration of PLA reached (51.7±1.0) mg/L in cell-free supernatant after 72,h incubation in fermentation liquor. Moreover, when phenylpyruvic acid (PPA) was added into medium,B. coagulansTQ33,could effectively convert PPA into PLA with a high PLA producing concentration of (726.1 ± 3.0) mg/L. The production increased 13-fold and the fermentation time decreased from 72,h to 24,h. The structure of PLA produced byB. coagulansTQ33,was proved to be L-PLA.

Bacillus coagulansTQ33；phenyllactic acid；phenylpyruvic acid

Q93

A

1672-6510(2014)06-0011-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.06.003

2013–12–18；

2014–04–26

國家自然科學基金資助項目(20876116，30900961)；乳品生物技術與工程教育部重點實驗室開放課題基金資助項目

王海寬（1974—），男，內蒙古人，教授，hkwang@aliyun.com.