脊柱模式生物斑馬魚(yú)用于內(nèi)耳科學(xué)領(lǐng)域研究的進(jìn)展

周金章 綜述 龍孝斌 審校

斑馬魚(yú)(danio rerio)屬鯉科、輻鰭亞綱、短擔(dān)尼魚(yú)屬，原產(chǎn)于印度等地水域。斑馬魚(yú)體型纖細(xì)，成魚(yú)體長(zhǎng)約3～5 cm,壽命2～3年；其胚胎及早期幼魚(yú)通體透明，生殖周期短、繁殖能力強(qiáng),且基因與人類基因約87%相似。鑒于斑馬魚(yú)以上生物學(xué)特性，耳科學(xué)研究者亦采用斑馬魚(yú)模型探討毛細(xì)胞再生、遺傳性聾機(jī)制、耳毒性和抗耳毒性藥物篩查等。為此，本文對(duì)近年來(lái)斑馬魚(yú)模型用于內(nèi)耳科學(xué)領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展綜述如下。

1 斑馬魚(yú)內(nèi)耳與側(cè)線系統(tǒng)解剖

斑馬魚(yú)雖無(wú)外耳和中耳，但具脊椎動(dòng)物之典型內(nèi)耳解剖結(jié)構(gòu)。斑馬魚(yú)內(nèi)耳由三個(gè)半規(guī)管(前、后和水平半規(guī)管)、耳石器官(橢圓囊、球囊和聽(tīng)壺)組成；半規(guī)管、橢圓囊主要行前庭平衡功能，而球囊及聽(tīng)壺則司聽(tīng)覺(jué)感知功能。除內(nèi)耳外，斑馬魚(yú)還具有另一感覺(jué)神經(jīng)器官—側(cè)線系統(tǒng)，其由大量單個(gè)神經(jīng)丘組成，每個(gè)神經(jīng)丘中央包含一簇由神經(jīng)支配的感覺(jué)毛細(xì)胞，其功能為探測(cè)自身局部水流及低頻振動(dòng)、調(diào)節(jié)諸如學(xué)習(xí)、逃避及撲食等行為[1]。由于側(cè)線毛細(xì)胞與內(nèi)耳毛細(xì)胞功能及分子結(jié)構(gòu)極為相似且便于活體觀察及干預(yù)，現(xiàn)已廣泛用于毛細(xì)胞發(fā)育、再生、聽(tīng)覺(jué)及前庭功能障礙研究[2]。

2 斑馬魚(yú)毛細(xì)胞損傷與再生研究

2.1斑馬魚(yú)毛細(xì)胞損傷模型的建立 類似哺乳動(dòng)物，斑馬魚(yú)對(duì)氨基糖苷類抗生素及順鉑等耳毒性藥物有類似敏感性。Harris等[3]利用新霉素?fù)p傷斑馬魚(yú)幼魚(yú)側(cè)線毛細(xì)胞，通過(guò)5-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)標(biāo)記顯示，毛細(xì)胞損傷后48小時(shí)可觀察到大量有標(biāo)記的增殖細(xì)胞，此種利用耳毒性藥物浸泡幼體斑馬魚(yú)損傷其毛細(xì)胞的方法簡(jiǎn)便有效，是目前研究斑馬魚(yú)毛細(xì)胞損傷的最常用方法；Schuck等[4]應(yīng)用連續(xù)噪聲刺激建立斑馬魚(yú)內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷模型并觀察毛細(xì)胞改變；而Uribe等[5]則采用慶大霉素腹腔注射法建立成年斑馬魚(yú)內(nèi)耳毛細(xì)胞損傷模型，亦取得滿意效果。

2.2斑馬魚(yú)再生毛細(xì)胞的來(lái)源 已知哺乳動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞缺乏再生能力，前庭感覺(jué)上皮細(xì)胞再生能力有限，而再生的毛細(xì)胞可能來(lái)源于前體干細(xì)胞[6]；相反，部分非哺乳脊柱動(dòng)物如鳥(niǎo)類、兩棲類及魚(yú)類，其毛細(xì)胞損傷后具有較強(qiáng)的再生能力；研究表明，鳥(niǎo)類支持細(xì)胞是再生毛細(xì)胞的來(lái)源且存在兩種再生方式，即直接分化(損傷早期)和分裂增殖[7]； Hernandez等[8]采用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的SqET4 和 SqET20轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)研究發(fā)現(xiàn)，其側(cè)線毛細(xì)胞在損傷后也存在與鳥(niǎo)類相似的再生方式，且再生毛細(xì)胞大多來(lái)源于表達(dá)Sox2(sex determining region Y related high mobility group box-2,SKY related HMG box-2)的前體細(xì)胞；Mackenzie等[9]采用新霉素、順鉑和硫酸銅等作用于側(cè)線毛細(xì)胞，并應(yīng)用氟苯達(dá)唑抑制細(xì)胞增殖后提示，支持細(xì)胞增殖對(duì)毛細(xì)胞再生過(guò)程起主要作用；而Ma等[10]研究發(fā)現(xiàn)，損傷后再生的毛細(xì)胞主要由側(cè)線神經(jīng)丘中央群的支持細(xì)胞分裂而來(lái)。

2.3參與斑馬魚(yú)毛細(xì)胞再生的基因及信號(hào)通路 與小鼠模型相似，斑馬魚(yú)atoh1基因(人類Math1的同源基因)也是維持毛細(xì)胞分化和發(fā)育所必需的，過(guò)表達(dá)atoh1也可產(chǎn)生大量毛細(xì)胞[11]；既往哺乳動(dòng)物模型研究認(rèn)為Sox2可維持多能干細(xì)胞的潛能或涉及早期細(xì)胞分化，Millimaki等[12]通過(guò)斑馬魚(yú)模型研究發(fā)現(xiàn)，Sox2具有維持毛細(xì)胞生存及再生過(guò)程中支持細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為毛細(xì)胞的功能；Lin等[13]研究發(fā)現(xiàn)，阻斷視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)基因與Raf-1蛋白激酶的交互作用可阻斷RB的磷酸化，進(jìn)而阻礙斑馬魚(yú)側(cè)線支持細(xì)胞增殖再生為毛細(xì)胞；Schuck等[14]則通過(guò)基因微陣列研究分析認(rèn)為，斑馬魚(yú)內(nèi)耳毛細(xì)胞在聲損傷后生長(zhǎng)激素的表達(dá)顯著上調(diào)，而通過(guò)腹腔注射人工合成的生長(zhǎng)激素可促進(jìn)內(nèi)耳毛細(xì)胞顯著增殖。

近年研究認(rèn)為，Notch信號(hào)通路存在于毛細(xì)胞再生過(guò)程中。在斑馬魚(yú)側(cè)線系統(tǒng)，Notch信號(hào)通路成員(notch3,deltaA,atoh1a)在氨基糖苷類抗生素誘發(fā)毛細(xì)胞損傷后24小時(shí)內(nèi)表達(dá)上調(diào)，此時(shí)支持細(xì)胞分裂活躍且新生毛細(xì)胞開(kāi)始形成[10]；Liang等[15]利用數(shù)字化基因表達(dá)技術(shù)發(fā)現(xiàn)信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator transcription,stat3)/細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,socs 3)(stat3/socs3)通路可調(diào)節(jié)斑馬魚(yú)毛細(xì)胞再生過(guò)程，且和哺乳動(dòng)物模型一樣，該通路也存在嚴(yán)格負(fù)反饋調(diào)節(jié)；最新研究提示W(wǎng)nt/beta-catenin信號(hào)通路也參與斑馬魚(yú)毛細(xì)胞再生調(diào)控，即活化Wnt信號(hào)可以促進(jìn)神經(jīng)丘內(nèi)靜止成熟的支持細(xì)胞重新進(jìn)入增殖狀態(tài)，而過(guò)表達(dá)dkk1b(Wnt信號(hào)抑制劑)則可抑制包括細(xì)胞分化和再生形式的增殖[16]。

3 斑馬魚(yú)在遺傳性聾中的應(yīng)用

3.1遺傳性聾斑馬魚(yú)模型 據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)新生兒極重度聾發(fā)病率約為1/1 000，其中50%以上與遺傳因素有關(guān)[17]。2000年Ernest等[18]首先報(bào)道斑馬魚(yú)mariner突變體可出現(xiàn)內(nèi)耳毛細(xì)胞束異常、內(nèi)耳微音器電位減弱等，此形態(tài)及功能缺陷與編碼異常肌球蛋白7a(myosin Ⅶa)小鼠shaker-1突變體極為類似；研究[19]發(fā)現(xiàn)，grhl2bT086突變系斑馬魚(yú)表現(xiàn)為聽(tīng)泡擴(kuò)大、耳石變小及半規(guī)管畸形，但其毛細(xì)胞發(fā)育正常，而注射人工合成野生型斑馬魚(yú)grhl2b、人類grhl2或小鼠grhl2(grainyhead-like 2)mRNA則可拯救突變表型，表明grhl2bT086突變斑馬魚(yú)品系為研究人類DFNA28漸進(jìn)性聽(tīng)力損失的理想動(dòng)物模型。此外可用于遺傳性聾的斑馬魚(yú)模型還包括eyal、colorless 、sputnik等。

3.2遺傳性聾發(fā)生機(jī)制 經(jīng)過(guò)近二十年努力，目前已鑒定出64個(gè)遺傳性聾基因[20]，但部分新穎基因并不能解釋聽(tīng)力損失的細(xì)胞或分子機(jī)制。Busch-Nentwich等[21]對(duì)斑馬魚(yú)同源基因DFNA5研究發(fā)現(xiàn)，該基因與尿苷二磷酸葡萄糖脫氫酶[uridinc 5’-diphos phate(UDP)-glucose dehyrogenase,Ugdh]的表達(dá)密切相關(guān)，而后者是細(xì)胞外基質(zhì)透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)形成的關(guān)鍵酶，故推測(cè)DFNA5的表達(dá)產(chǎn)物主要扮演細(xì)胞外基質(zhì)的角色；轉(zhuǎn)錄因子sox10突變與Waardenburg 綜合癥相關(guān)，但其調(diào)控機(jī)制仍不明確，Dutton等[22]通過(guò)體內(nèi)檢測(cè)斑馬魚(yú)DNA片段聯(lián)合比較基因組學(xué)的方法認(rèn)為， Tcf/Lef、Sox及FoxD3等轉(zhuǎn)錄因子靶位點(diǎn)可促進(jìn)sox10在神經(jīng)嵴及內(nèi)耳上皮表達(dá)；Riazuddin等[23]對(duì)耳聾家系研究發(fā)現(xiàn)CIB2突變可導(dǎo)致人類非綜合型DFNB48遺傳性聾，此基因可編碼Ca2+及整合素結(jié)合蛋白，通過(guò)嗎啉環(huán)修飾的寡核苷酸(morpholinos，MOs)抑制斑馬魚(yú)CIB2的表達(dá)，導(dǎo)致斑馬魚(yú)神經(jīng)丘發(fā)育缺損、毛細(xì)胞微音器電位減弱；Yariz等[24]通過(guò)全外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，OTOGL基因可編碼耳膠蛋白類似物，而MOs抑制OTOGL表達(dá)后，導(dǎo)致斑馬魚(yú)內(nèi)耳解剖結(jié)構(gòu)異常及感音性聽(tīng)力損失。

4 斑馬魚(yú)用于藥物篩查研究

4.1耳毒性藥物篩查 耳毒性藥物主要導(dǎo)致聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞損傷甚至消失，但因缺少簡(jiǎn)便有效的聽(tīng)覺(jué)評(píng)價(jià)模型，臨床批準(zhǔn)上市的藥物多無(wú)耳毒性評(píng)估指標(biāo)。2005年Ton等[25]首次應(yīng)用斑馬魚(yú)模型評(píng)估藥物耳毒性效應(yīng)，并初步建立了斑馬魚(yú)藥源耳毒性模型；隨后Chiu等[26]利用斑馬魚(yú)藥源模型篩查了FDA批準(zhǔn)上市的1 040余種藥物，結(jié)果提示21種為耳毒性化合物，包括斯伐他汀、坎地沙坦、長(zhǎng)春胺等；2011年，Hirose等[27]對(duì)美國(guó)國(guó)家癌癥研究所批準(zhǔn)的88種抗腫瘤藥物進(jìn)行篩查，提示13種藥物具有耳毒性，包括已知的藥物如順鉑、氮芥等及可疑的藥物如長(zhǎng)春瑞濱、伊馬替尼、阿霉素等。

4.2抗耳毒性藥物篩查 既往文獻(xiàn)顯示，約50余種藥物對(duì)毛細(xì)胞具有保護(hù)作用且大多數(shù)藥物的保護(hù)作用并不完全。Owens等[28]采用新霉素建立斑馬魚(yú)藥物性耳毒性模型，并對(duì)10 960種類藥性小分子化合物進(jìn)行篩查，提示PROTO-1、PROTO-2兩種苯并噻吩甲酰胺類化合物能拮抗新霉素的耳毒性損傷；Ou[29]和Vlasits[30]等分別篩選了FDA批準(zhǔn)的部分藥物，發(fā)現(xiàn)他克林、它莫西芬和六氫芬寧等可拮抗部分氨基糖苷類抗生素的耳毒性損傷；Coffin等[31]采用側(cè)線神經(jīng)丘對(duì)61種已知的細(xì)胞死亡相關(guān)的分子靶點(diǎn)藥理抑制劑進(jìn)行篩查，結(jié)果提示自噬抑制劑(3-MA)、絲氨酸蛋白酶抑制劑(FUT-175)和蛋白酶體抑制劑(Z-LLF-CHO)均可有效拮抗新霉素、慶大霉素及順鉑的耳毒性。

5 斑馬魚(yú)用于行為學(xué)研究

因斑馬魚(yú)體型小、便于觀察，通過(guò)其行為學(xué)特征可以簡(jiǎn)潔、有效地分析聽(tīng)覺(jué)、平衡感覺(jué)整合功能，如背光反應(yīng)、前庭眼動(dòng)反射等可有效評(píng)價(jià)斑馬魚(yú)前庭功能；聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)驚恐反射存在與否可用來(lái)篩查聽(tīng)覺(jué)功能缺陷的個(gè)體[32]；而趨流性實(shí)驗(yàn)則可評(píng)價(jià)側(cè)線毛細(xì)胞功能[33]；在聽(tīng)覺(jué)研究方面，Cervi等[34]首次利用行為學(xué)的方法描述了斑馬魚(yú)的聽(tīng)覺(jué)功能，實(shí)驗(yàn)采用食物獎(jiǎng)賞與聲覺(jué)刺激相結(jié)合的方法探討斑馬魚(yú)聽(tīng)覺(jué)敏感聲頻范圍，發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)的行為聽(tīng)覺(jué)敏度與訓(xùn)練采用的聲刺激頻率高度相關(guān)。

目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)聽(tīng)覺(jué)及耳聾的斑馬魚(yú)模型研究尚處于起步階段，成年斑馬魚(yú)內(nèi)耳解剖、毛細(xì)胞分離和聽(tīng)覺(jué)誘發(fā)電位測(cè)量技術(shù)已經(jīng)成熟，而隨著斑馬魚(yú)基因組計(jì)劃的進(jìn)一步完善以及全球范圍內(nèi)更多斑馬魚(yú)研究實(shí)驗(yàn)室的建立，斑馬魚(yú)模型在內(nèi)耳科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用也將更加廣泛。

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