中藥野艾揮發(fā)物抗菌活性與化學成分分離鑒定研究

任維華，李偉華

(萊蕪市人民醫(yī)院藥劑科，山東 萊蕪 271100)

野艾屬于菊科蒿屬草本植物，俗名苦艾、野艾蒿等，是我國的傳統(tǒng)中藥，其性涼、味苦、辛，富含揮發(fā)油，有特殊香味，具有抗菌消炎、抗病毒、止咳止血、抗過敏等作用[3]。在我國分布范圍較廣，常見于荒野、草地、林邊及丘陵地帶，也有部分人工種植。本研究對野艾揮發(fā)油進行提取分離和成分鑒定，并研究其對微生物的殺滅抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

原材料野艾購于深圳福田中醫(yī)院，產(chǎn)地廣東，超臨界萃取裝置、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀等均為國內(nèi)研發(fā)制作。試驗所用蒸餾水均采用自動雙重純水蒸餾器制作，菌株均來自武漢大學的菌種保藏中心，實驗采用牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)基(NA：酵母浸膏1 g，牛肉浸膏4 g，蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，瓊脂15 g，水1 L，pH7.0，121℃滅菌 30 min)培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油提取 萃取法[1]：①將收集的野艾地上部分洗凈陰干切碎稱重為8.9 kg，裝入萃取裝置；②萃取裝置溫度設置為35 ℃，排除裝置中的空氣；③打開壓縮機，調(diào)節(jié)儀器內(nèi)部壓強保持在16 MPa，調(diào)節(jié)錯誤未找到引用源。出口閥，保存20 kg/h；持續(xù)80 min，打開分離器，取出萃取物；④關閉萃取裝置，取出揮發(fā)油粗制提取物，然后放入2倍的無水乙醇攪拌均勻，靜止24 h；⑤真空抽濾，再除去蠟質(zhì)沉淀物，最后將濾液在30°回收乙醇，得到精制野艾揮發(fā)油。

1.2.2 抑菌圈測定 實驗對野艾揮發(fā)油的抑菌效果測定使用的是濾紙片瓊脂平板擴散法。首先，在3個固體平板均勻涂上牛肉汁蛋白胨培養(yǎng)液；其次，取已滅菌的濾紙片(7 mm)黏取約15 μL，將已稀釋好的揮發(fā)油樣品置于平板上，每個菌種取6個平行組；最后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細菌組溫度為36° 24 h，真菌組溫度為27° 48 h，并測算菌落直徑3次求取平均值，以左旋氧氟沙星為對照。

1.2.3 MIC和MBC的測定 采用稀釋法對最低殺菌濃度MCI和最低抑菌濃度MBC進行測定。在96孔平板上涂上液體培養(yǎng)基接種菌落，再加入已稀釋好的各濃度揮發(fā)油樣品，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細菌組溫度為36°24 h、真菌組溫度為27°48 h后觀察，每個菌種的每個揮發(fā)油樣品相同稀釋度的實驗各3組，重復2次。MIC的確定標準[5]：肉眼無法觀察到培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)物渾濁的樣品為最低抑菌濃度。MBC的確定標準：首先是取出培養(yǎng)后無渾濁的平板再培養(yǎng)，以再培養(yǎng)后平板無菌落生成為最低樣品的抑制濃度，并以左旋氧氟沙星為對照。

1.2.4 使用質(zhì)譜聯(lián)用儀對野艾揮發(fā)油進行化學成分分離鑒定 首先，將揮發(fā)油樣品以1∶5的比例溶于乙酸乙酯，搖勻分流進樣。鑒定分以下兩部分：①色譜條件：色譜柱-25 m×0.25 mm，柱溫-前2 min保持45℃，再以5℃每分鐘的速度提高至100℃，保持2 min，再以10℃每分鐘提高到220℃.進樣量0.5 μL，流速1 mL·min-1,載氣He, 分流比30, He。采用歸一化法計算其相對的百分比含量；②質(zhì)譜條件：進物口溫度220℃，EL電離方式，電離電壓為70 EV，離子源溫度為330℃，掃描范圍35～350 amu，各組成成分分子式通過NIST進行檢索。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS及EXCEL等軟件進行統(tǒng)計分析,實驗通過反復統(tǒng)計分析所得。

2 結(jié)果

2.1 野艾揮發(fā)油的主要成分

經(jīng)氣相色譜分離出揮發(fā)油中的39種成分，經(jīng)質(zhì)譜圖NIST檢索確認，再用面積歸一化法分析其各自的相對含量，其余成分因各種原因未能確認。表1顯示，野艾揮發(fā)油的主要5種成分分別為蒿酮15.52%、蒿醇9.63%、順式丁香烯8.71%、艾醇7.37%和桉葉素6.47%等。

表1 野艾揮發(fā)油 GC- MS 分析結(jié)果和化學成分

2.2 野艾揮發(fā)油對三類菌的抗菌效果

對革蘭氏陽性菌的抗菌效果相對較好,對真菌的效果一般，對革蘭氏陰性菌無效。

3 結(jié)論

實驗對野艾揮發(fā)油的化學成分研究采用了氣-質(zhì)聯(lián)用的分析方法，首先通過使用超臨界錯誤，未找到引用源。萃取法對野艾揮發(fā)油進行分類提純鑒定，其次再使用氣相色譜對揮發(fā)油進行成分分離鑒定，查出揮發(fā)油中所含有的各化學成分組成，再利用歸一法測算揮發(fā)油中各化學成分的相對百分含量，最后再通過質(zhì)譜聯(lián)用儀進行確定，采用NIST計算機分子庫進行自動檢索，確定揮發(fā)油中的各種化學成分及其含量。

表2 野艾揮發(fā)油對各種微生物的抗菌活性

注：DD,抑菌圈直徑(MM)；NA,無活性

對于野艾的殺菌抑菌研究也表明，野艾揮發(fā)油對測試菌種有較強的抑制和殺滅作用，尤其是對革蘭氏陽性菌的殺菌活性很強。在過往的研究中也曾有過類似的報道[2]，蒿酮、蒿醇和桉葉素對革蘭氏陽性菌有很強的殺滅作用，對部分真菌和革蘭氏陰性菌也有抑制作用。可以看出，這3種物質(zhì)是野艾抗菌的物質(zhì)基礎，野艾揮發(fā)油對幾種細菌的生長抑制作用會隨著揮發(fā)油濃度的提高而加強。

本文對揮發(fā)油抗菌活性的研究還利用了揮發(fā)油中芳香類化合物包括檸檬烯、蒎烯等的抗菌作用，尤其是萜類的化合物。有數(shù)據(jù)[4]顯示，芳香族化合物(如檸檬烯)的特點一是具有較強的香氣，二是具有較好的抗菌效果，三是具有較高的藥物成分，四是具有較大的生物活性，因此是制作生態(tài)抗病毒殺菌劑的合理材料。

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