類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎與表觀遺傳學(xué)?

巨少華， 代 淵， 王 平， 徐世軍△

(1.四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開(kāi)發(fā)利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 611137)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為主的全身性自身免疫性疾病，以滑膜增生、慢性侵蝕性炎癥和自身免疫進(jìn)程為特征，常常累及周圍關(guān)節(jié)[1]。其病理表現(xiàn)主要為由免疫反應(yīng)引起的滑膜炎、增生和肉芽浸潤(rùn)，從而破壞關(guān)節(jié)的軟骨面、軟骨下骨質(zhì)、關(guān)節(jié)囊、韌帶和肌腱組織，逐漸導(dǎo)致關(guān)節(jié)的強(qiáng)直、畸形和功能嚴(yán)重受損，表現(xiàn)為慢性對(duì)稱性的關(guān)節(jié)炎[2]。我國(guó)RA患病率為0.32～0.36%左右[3]，世界上約有1%的人受其影響[4]。近年來(lái)對(duì)于RA發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知和治療策略有了顯著的改善[5]，最新的生物制劑如TNF-α針等應(yīng)用治療RA取得了一定的進(jìn)展，但還是沒(méi)有徹底治愈此類疾病。在過(guò)去的幾年，人們發(fā)現(xiàn)RA滑膜成纖維細(xì)胞(rheumatoid arthritis synovialbroblasts,RASF)為RA病情的發(fā)展和關(guān)節(jié)破壞的關(guān)鍵因素。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在沒(méi)有細(xì)胞免疫和體液免疫的情況下，RASF依舊可保持其活化表型[6]并破壞軟骨，且與正?；こ衫w維細(xì)胞的形態(tài)和基因表達(dá)模式不同[7]，表觀遺傳修飾在RA的病程變化中扮演了重要的角色。

表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是傳統(tǒng)遺傳學(xué)的分支，最早由英國(guó)科學(xué)家Waddington于1942年提出[8]。其涵義為DNA序列不發(fā)生改變的情況下，基因的表達(dá)與功能發(fā)生改變，并產(chǎn)生可遺傳的表型，在生物體內(nèi)從一代傳到另一代[9，10]。這種現(xiàn)象首先在植物中被發(fā)現(xiàn)[11],現(xiàn)已擴(kuò)大到酵母、果蠅、小鼠和人類等[12～14]。表觀遺傳學(xué)主要有以下調(diào)節(jié)機(jī)制，即DNA甲基化[15]、組蛋白甲基化及乙?；痆16]及非編碼RNA[17]。 本文主要從RASF的表觀遺傳修飾，特別是不同的表觀遺傳修飾在RA發(fā)展中的作用進(jìn)行闡述。

1 DNA甲基化與RA

DNA甲基化是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化S腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶的反應(yīng)[18]。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的一個(gè)重要修飾，在哺乳動(dòng)物中DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸上，涉及整個(gè)基因組70～80%的CpG位點(diǎn)[19]。生物體一生中都發(fā)生著DNA甲基化模式的改變，一些變化可能是環(huán)境改變的生理反應(yīng)，另外一些變化可能與惡性轉(zhuǎn)化或細(xì)胞老化等病理進(jìn)程有關(guān)。

DNA甲基化模式的可繼承性使基因組的表觀遺傳標(biāo)記在大量的細(xì)胞分裂過(guò)程中得以穩(wěn)定，從而建立了一種細(xì)胞記憶的形式。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，RA患者存在基因組DNA的廣泛低甲基化，尤其是滑膜成纖維細(xì)胞(RASF)內(nèi)的DNA長(zhǎng)散布核元件(LINE-1)啟動(dòng)子上富含GC的CpG島序列，其發(fā)生低甲基化作用導(dǎo)致某些基因的異常表達(dá)，從而參與RA的全身及關(guān)節(jié)局部炎癥[20]。研究者發(fā)現(xiàn)，RA組織中正常沉默逆轉(zhuǎn)錄L1因子存在異常表達(dá)，用甲基化試劑5-氮-2’-脫氧胞苷培養(yǎng)滑膜成纖維細(xì)胞(SF)的誘導(dǎo)治療，揭示了DNA低甲基化在RA發(fā)病過(guò)程中起到了功能性作用[21]。基于以上跡象，研究人員對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(RASF)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組織全部DNA低甲基化進(jìn)行檢測(cè)，并在低甲基化環(huán)境中培養(yǎng)正?；こ衫w維細(xì)胞得到了與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(RASF)相類似的活化表型[22]。所有DNA低甲基化被證明是由于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(RASF)多胺代謝的增加和S-腺苷-L-甲硫氨酸水平下降所致[23]。另外，除了在RA中DNA甲基化模式有所改變外，單個(gè)基因例如趨化因子(CXC基序)、配體12(CXCL-12)的啟動(dòng)子區(qū)域也發(fā)生甲基化[24]。最近研究表明，單一CpG序列中IL -6[25，26]和IL-10[27，28]基因的啟動(dòng)子去甲基化與基因表達(dá)水平有關(guān)，因此有助于在疾病過(guò)程中細(xì)胞因子水平的提高，這也反映了DNA甲基化與RA發(fā)病過(guò)程中炎癥的相關(guān)起因。

分子和遺傳學(xué)研究都表明DNA胞嘧啶甲基化與沉默基因有關(guān)，并且在諸如X染色體失活、基因印記等事件中起重要作用。DNA甲基化參與RA發(fā)病機(jī)制的另一項(xiàng)研究主要是對(duì)女性第2個(gè)X染色體沉默進(jìn)行調(diào)查，這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了在RA患者中傾斜性XCI狀態(tài)升高。而隨機(jī)XCI，至少有80%的細(xì)胞表現(xiàn)出相同的X染色體失活[29]，說(shuō)明XCI嵌合體參與了RA的發(fā)病，并且這也可能是為什么RA在女性中更為普遍的原因。

2 組蛋白修飾與RA

組蛋白包括組蛋白 H1、H2A、H2B、H3和H4，H2A、H2B、H3和 H4組蛋白各2個(gè)分子形成1個(gè)8聚體, 組蛋白H1起到連接的作用, 把每個(gè)核小體連接到一起。組蛋白通過(guò)裝入核小體核心部分以包裝DNA，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)環(huán)繞其上。組蛋白在進(jìn)化中進(jìn)一步多樣化為各種變體，產(chǎn)生了具有表觀遺傳學(xué)效果的染色質(zhì)分化。組蛋白修飾包括組蛋白的乙?；c去乙?；⒓谆c去甲基化、組蛋白的磷酸化及泛素化，這些修飾因素單一或共同作用來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)與功能的發(fā)揮[30]。在RA中組蛋白主要通過(guò)乙?；⑷ヒ阴；图谆瘏⑴c病情的發(fā)展。

組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙酰化酶(HDACs)相互調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白乙?；癄顟B(tài)。人類的18種HDACs已經(jīng)被確定并分為4種類型(表1)，其抑制劑常被用于研究RA的發(fā)病機(jī)制。HATs和HDACs不僅針對(duì)組蛋白，而且還針對(duì)其他蛋白質(zhì)如轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子3。這些轉(zhuǎn)錄因子在炎癥過(guò)程中扮演著重要的角色，同時(shí)參與了RA的發(fā)病過(guò)程。在對(duì)關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)，與正常個(gè)體比較，RA滑膜組織中總組蛋白酶去乙?；富钚栽黾?，且總滑膜組蛋白去乙?；富钚院虷DAC1表達(dá)與TNF-α含量密切相關(guān)。TNF-α對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞的刺激導(dǎo)致細(xì)胞滑膜組蛋白去乙酰化酶活性和HDAC1表達(dá)暫時(shí)性的增加。由TNF-α刺激的組蛋白去乙?；富钚耘c表達(dá)的時(shí)序變化與滑膜成纖維細(xì)胞因子信號(hào)蛋白相一致，包括核因子-κB-B(NF-κB)p65、JAK / STAT信號(hào)混合物、AP -1 和p53，因此在RA滑膜成纖維細(xì)胞中，組蛋白去乙?；敢种苿┳柚筃F-κB p65的激活[31]，基因調(diào)控的表觀遺傳機(jī)制認(rèn)為這有助于對(duì)免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病復(fù)雜病理的認(rèn)識(shí)。Nishida和他同事的研究結(jié)果證實(shí)，HDAC抑制劑FK228通過(guò)誘導(dǎo)P21和P16基因啟動(dòng)子的乙?；瘉?lái)抑制RASF的增殖[32]。高劑量的TSA和Nicotinamide可以使RA巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[33]。因此，HDAC抑制劑可能對(duì)RA滑膜增生產(chǎn)生積極的影響：一方面通過(guò)抑制RASF的增殖，另一方面在巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。炎癥部位組蛋白去乙?；富钚越档团c炎癥部位疾病的嚴(yán)重程度、炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生和糖皮質(zhì)激素抵抗有一定的相關(guān)性，組蛋白去乙酰化酶活性降低可能有助于RA病理認(rèn)識(shí)和在未來(lái)使用組蛋白去乙?；敢种苿?duì)RA患者進(jìn)行抵抗治療[34]。

關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型已證明HDAC抑制劑在體內(nèi)的有益效果[32，35～38]。自身抗體介導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模型全身HDAC抑制劑FK228給藥減少了關(guān)節(jié)腫脹、滑膜炎癥和骨與軟骨的破壞[32]。在CIA關(guān)節(jié)炎大鼠和小鼠中研究了HDAC抑制劑SAHA和MS-275的預(yù)防性和治療性影響，這項(xiàng)研究得出HDAC抑制劑是一種創(chuàng)新的RA治療策略的結(jié)論[35]。在同一模型中，TSA的量效可以減少關(guān)節(jié)炎的臨床體征。筆者觀察到組蛋白H4乙?；?xì)胞、MMP1(TIMP1)的組織抑制因子、陽(yáng)性細(xì)胞分別增加，免疫組化染色檢測(cè)到MMP3和MMP13的陽(yáng)性軟骨細(xì)胞信號(hào)降低[36]。此外，HDAC抑制劑丙戊酸(VPA)能顯著降低CIA小鼠的發(fā)病率和嚴(yán)重性。這些影響通過(guò)改善CD25+FOXP3+調(diào)控的T細(xì)胞的功能來(lái)發(fā)揮作用，而CD25+FOXP3+調(diào)控的T細(xì)胞在RA患者中是有缺陷的[37]。

在RA發(fā)病機(jī)制中，除了乙?；酝膺€有其他組蛋白修飾作用外，研究發(fā)現(xiàn)了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(RASF)中組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶(EZH2)的過(guò)度表達(dá)。EZH2是多梳基因家族抑制復(fù)合體2的催化亞基，它給特定沉默基因H3K27添加了三甲基標(biāo)記物。作為一種MMTV整合位點(diǎn)(Wnt)信號(hào)通路抑制劑，它的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致相關(guān)蛋白分泌減少，在RA發(fā)展中起著重要作用，并與關(guān)節(jié)炎癥發(fā)病機(jī)制有一定的牽連[39]。

表1 組蛋白去乙酰化酶的分類及其抑制劑[40]

人類組蛋白去乙?；?HDACs)分為4個(gè)小組。SAHA為辛二酰苯胺異羥肟酸，SIRT為sirtuin，TSA為曲古抑菌素A，VPA為丙戊酸。

3 miRNA與RA

miRNA是大小約22個(gè)核苷酸(nts)的內(nèi)源性非編碼小RNA，對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，參與細(xì)胞增殖、分化、代謝和凋亡等過(guò)程。它通過(guò)結(jié)合靶基因的3’非翻譯區(qū)起到基因表達(dá)翻譯后的阻遏作用，這導(dǎo)致了翻譯過(guò)程的降解或抑制。

這些miRNA分子在沒(méi)有基因編碼序列改變的情況下能夠改變基因和蛋白的表達(dá), 所以它們?cè)诒碛^遺傳修飾中有著重要作用。對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(RASF)和骨關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(OASF)中260個(gè)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(RASF)中miRNA一列數(shù)組存在過(guò)度表達(dá)，最為突出的是miR-203。RASF中miR -203的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致MMP1表達(dá)增加并提高了IL-6的分泌率[41]。另外，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(RASF)中下調(diào)和受啟動(dòng)子區(qū)域甲基化調(diào)節(jié)的miRNA是miR-34A*，miR-34A*表達(dá)下降導(dǎo)致了其靶點(diǎn)伴X染色體抑制凋亡蛋白的上調(diào)，從而有助于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞(RASF)抗凋亡表型的產(chǎn)生[42]。

4 總結(jié)與展望

通過(guò)對(duì)RASF中DNA甲基化、組蛋白修飾、miRNA的研究，我們發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)與RA的病理機(jī)制密切相關(guān)。一些研究表明，表觀遺傳學(xué)對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖細(xì)胞內(nèi)在表型的激活起一定作用[43]，這些同時(shí)也可以作為動(dòng)物模型中探究RA表觀遺傳學(xué)機(jī)制的數(shù)據(jù)點(diǎn)?，F(xiàn)在仍舊需要更多數(shù)據(jù)來(lái)闡明何種修飾引起RA的發(fā)生，何種遺傳變化產(chǎn)生于慢性疾病中。雖然在RA中DNA甲基化的不同模式圖變得越來(lái)越清晰，但仍有一些表觀遺傳修飾尚未研究，或者已發(fā)現(xiàn)的修飾在RA發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮何種作用。表觀遺傳學(xué)和miRNA介導(dǎo)的改變與疾病的研究正變得越來(lái)越重要，這些進(jìn)程直接參與基因的異常表達(dá)，并最終確定細(xì)胞功能和藥理學(xué)的可逆性。

遺傳和環(huán)境因素在風(fēng)濕免疫疾病中扮演著重要角色，而這兩者也在同卵雙胞胎的部分一致性中得到體現(xiàn)。此外，環(huán)境在確定自身免疫性疾病中起著關(guān)鍵作用。許多環(huán)境因素，包括暴露于化學(xué)品、煙草煙霧、輻射、紫外線(UV)光、傳染性病原體等其他外部因素，都與風(fēng)濕免疫疾病的發(fā)展有關(guān)。目前研究表明，這些環(huán)境因素直接或間接誘發(fā)表觀遺傳與細(xì)胞功能的變化，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。因此，表觀遺傳學(xué)提供了一個(gè)源自分子的機(jī)制來(lái)解釋環(huán)境對(duì)自身免疫性疾病發(fā)展上的影響[44]。環(huán)境、表觀遺傳狀態(tài)和自身免疫性風(fēng)濕性疾病之間的密切關(guān)系也常利用動(dòng)物模型來(lái)例證，這種類型的研究為疾病的產(chǎn)生、發(fā)展和治療成效提供了新的臨床鑒定指標(biāo)。

總之，表觀遺傳學(xué)的認(rèn)識(shí)和研究已經(jīng)使人類在基因方面邁上了一個(gè)新的臺(tái)階。表觀遺傳學(xué)將作為新的武器，對(duì)一些重大的和難以攻克的醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)難題做出解答。RA的表觀遺傳學(xué)研究任重而道遠(yuǎn)，希望在未來(lái)對(duì)RA表觀遺傳調(diào)節(jié)機(jī)制的詳盡掌握有助于開(kāi)發(fā)出新的藥物，能夠預(yù)防或者徹底根治RA。

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