糖脂清顆粒對2型糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬IRS-1表達的影響?

王 旭，徐奚如，洪 兵，顧震宇，俞晶華

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬淮安市中醫(yī)院，江蘇 淮安 223001)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)是老年人群中最常見的代謝性疾病。越來越多的證據(jù)表明，T2DM有加速老年人群認(rèn)知功能下降的風(fēng)險，有學(xué)者稱之為“加速的腦老化”，甚至發(fā)展為阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)[1]。近年來，隨著研究的逐漸深入，越來越多的證據(jù)表明，T2DM與認(rèn)知功能障礙有關(guān)。尤其是60歲以上的老年人，糖尿病與其他影響癡呆過程的疾病如阿爾茨海默病等相互作用，能加快認(rèn)知功能減退，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)[2]。王旭根據(jù)多年臨床經(jīng)驗，運用糖脂清方治療本病取得了滿意的療效。本研究在高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素注射建立的2型糖尿病大鼠模型上觀察中藥復(fù)方糖脂清顆粒對糖代謝及腦內(nèi)胰島素受體底物1(IRS-1)表達的影響，以探討糖脂清顆粒對糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的防治作用及機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量200 g～220 g，8周齡，由浙江省實驗動物中心提供(動物許可證號scxk浙20080033)。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，每籠3只分籠飼養(yǎng)，濕度40%～60%，室溫18℃～22℃，普通飼料喂養(yǎng)，自由進食進水，天黑前喂食。動態(tài)觀察大鼠的進食量和飲水量，每周稱體質(zhì)量1次，每日更換籠子墊料1次。

1.2 實驗藥物及主要試劑

糖脂清(由黃精、炙僵蠶、鬼箭羽、枸杞、澤蘭等組成)由南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑部提供并加工，4℃保存?zhèn)溆?；吡格列?瑞彤)購于南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院西藥房(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20040631)。將藥片研磨成粉末，生理鹽水按1.5 mg/kg給藥劑量配制成混懸液，4℃保存。主要試劑有鏈脈佐菌素(Sigma公司，美國)、胰島素ELISA試劑盒(英國R&G公司生產(chǎn)，上海元象醫(yī)療器械有限公司分裝)、IRS-1抗體(Santa cruz公司，美國)、Envision免疫組化檢測試劑盒(福建邁新生物技術(shù)有限公司)。

1.3 模型建立及動物分組

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為正常組(10只)和造模組(40只)，正常組喂養(yǎng)普通飼料，造模組以高脂飼料喂養(yǎng)8周后禁食12 h，腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，30 mg/kg)。隨機血糖≥16.7 mmol/L確定為糖尿病大鼠模型[3]。將成模大鼠(40只)隨機分為糖尿病模型組、吡格列酮治療組、糖脂清高劑量組、糖脂清中劑量組。將吡格列酮治療組給予吡格列酮1.5 mg/(kg·d)灌胃，糖脂清高劑量組、糖脂清中劑量組給予中藥復(fù)方制劑灌胃，給藥劑量按陳奇主編的《中藥藥理研究方法學(xué)》劑量折算公式換算[4]；正常組與糖尿病模型組給予等量生理鹽水灌胃共4周。

1.4 生化及免疫指標(biāo)檢測

大鼠血糖測定采用血糖儀測法，空腹血清胰島素測定嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5 認(rèn)知功能檢測

每組隨機選擇6只大鼠進行Morris水迷宮測試。本實驗所用水迷宮為一直徑150 cm、高50 cm的圓形水池，池內(nèi)水深31 cm(適應(yīng)階段為29 cm)，水溫維持在(26±1)℃。水迷宮測試由熟悉適應(yīng)、隱藏平臺及空間探索3部分組成。水迷宮訓(xùn)練前1 d為熟悉適應(yīng)過程，逃逸平臺暴露且高出水面1 cm，將大鼠置于平臺上適應(yīng)60 s，隨后分別從4個象限將大鼠面壁放入水迷宮自由游泳120 s適應(yīng)環(huán)境，記錄大鼠尋求并登上平臺所需時間，即逃避潛伏期(latency)；若120 s后大鼠未找到平臺，則將其引導(dǎo)至平臺并停留60 s，共進行4次訓(xùn)練。隱藏平臺實驗歷時5 d，逃逸平臺隱藏于水下1 cm。每天每只大鼠接受4次訓(xùn)練，記錄方式同適應(yīng)階段?？臻g探索實驗在最后一次隱藏平臺實驗結(jié)束后24 h開始，撤去平臺，將大鼠從目標(biāo)象限的對面象限中點放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠在4個象限的游泳時間百分比及穿過原平臺所在位置的次數(shù)。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

給藥第4周末處死大鼠后取腦，電子稱重后，取部分組織分別用4%多聚甲醛溶液固定及液氮凍存。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)分析檢測各組大鼠腦組織胰島素受體底物1(IRS-1)在各組大鼠海馬部位的表達。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 治療前后血糖

表1顯示，造模成功后、治療前，即實驗第8周模型組、吡格列酮組、糖脂清高劑量組、糖脂清中劑量組大鼠空腹血糖與正常組比較均顯著升高(P<0.01)，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后糖脂清中劑量組、吡格列酮組空腹血糖與治療前比較均降低(P<0.05)，與模型組比較均降低(P<0.05)。治療后糖脂清高劑量組空腹血糖與治療前比較降低(P<0.01)，與模型組比較降低(P<0.01)。

表1 造模成功后各時間點大鼠空腹血糖變化

注：治療前后組內(nèi)比較：★P<0.05，★★P<0.01；與模型組比較：⊿P<0.05，⊿⊿P<0.01

2.2 治療前后空腹血清胰島素

表2顯示，模型組空腹血清胰島素水平明顯低于正常組(P<0.05)。糖脂清高劑量組、糖脂清中劑量組及吡格列酮組大鼠治療后空腹血清胰島素值高于治療前(P<0.05)，糖脂清高劑量組、糖脂清中劑量組及吡格列酮組空腹血清胰島素值高于糖尿病模型組(P<0.05)。

2.3 Morris水迷宮測試

2.3.1 定位航行實驗 表3圖1顯示，時間因素(day)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明逃避潛伏期有隨時間變化的趨勢；但時間和分組的交互作用無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明時間因素的作用不隨分組的不同而不同。

表2 糖脂清顆粒對糖尿病合并代謝綜合征大鼠血清胰島素的影響

注：治療前后組內(nèi)比較：★P<0.05；與模型組比較：⊿P<0.05

表3 各組大鼠逃避潛伏期

圖1 各組大鼠逃避潛伏期

2.3.2 空間探索實驗 表4顯示，撤去平臺后，吡格列酮組、糖脂清中劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)均多于模型組(P<0.05)，正常組、糖脂清高劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)均多于模型組(P<0.01)。吡格列酮組、糖脂清高劑量組及糖脂清中劑量組大鼠穿越平臺次數(shù)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。撤去平臺后，正常組及糖脂清高劑量組大鼠穿越原平臺象限游泳時間/總時間高于模型組(P<0.05)。

表4 撤去平臺后各組大鼠穿越原平臺次數(shù)及穿越原平臺象限游泳時間/總時間

注：與模型組比較：⊿P<0.05，⊿⊿P<0.01

2.4 海馬組織IRS-1表達水平

表5顯示，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織IRS-1水平較正常組明顯降低(P<0.05)，吡格列酮組、糖脂清高劑量組大鼠海馬組織IRS-1水平均較模型組升高(P<0.01)，糖脂清中劑量組大鼠海馬組織IRS-1水平較模型組高(P<0.05)。

表5 各組大鼠IRS-1的表達

注：與模型組比較：⊿P<0.05，⊿⊿P<0.01

3 討論

2型糖尿病(T2DM)是老年人群中最常見的代謝性疾病。越來越多的證據(jù)表明，T2DM有加速老年人群認(rèn)知功能下降的風(fēng)險。流行病學(xué)研究證實，2型糖尿病已成為認(rèn)知功能損害的獨立危險因素[5]。糖尿病合并認(rèn)知功能障礙屬于獲得性認(rèn)知行為缺陷為特征的糖尿病慢性并發(fā)癥，中醫(yī)學(xué)中沒有直接對應(yīng)的病名，依據(jù)其臨床表現(xiàn)屬于消渴病中出現(xiàn)的“健忘”、“善忘”、“呆病”、“癡證”、“愚癡”、“文癡”等范疇。古醫(yī)籍認(rèn)為“呆病”的基本病機為本虛標(biāo)實，本虛主要責(zé)之腎虛和氣血虧虛，標(biāo)實主要責(zé)之痰阻、血瘀、氣滯、毒邪等，諸邪往往兼夾共存、交互為患，其中腎虛尤為重要[6]。根據(jù)2型糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的相關(guān)理論，王旭根據(jù)多年臨床觀察并結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)研究創(chuàng)立了糖脂清顆粒。該方由黃精、炙僵蠶、鬼箭羽、枸杞、澤蘭等中藥組成，其中黃精補氣養(yǎng)陰、健脾益腎，僵蠶祛風(fēng)化痰散結(jié)，鬼箭羽破血通經(jīng)、散瘀止痛，枸杞子滋補肝腎、益精明目，澤蘭活血化瘀、行水消腫。一藥多效，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，切合脾腎虧虛、痰瘀互結(jié)病機，既治2型糖尿病合并認(rèn)知功能障礙痰瘀互結(jié)之標(biāo)，又療脾腎虧虛之本。本方藥物經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)驗證，具有調(diào)節(jié)血糖、血脂、改善血流動力學(xué)等作用[7～11]。

胰島素是維持生命進行正常生理活動所必需的激素。業(yè)已證明，腦組織是胰島素的靶器官。對脊椎動物胰島素的研究重點主要集中在它的外周作用。但近年來胰島素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用越來越受到關(guān)注，相關(guān)研究也表明胰島素具有一定的神經(jīng)細胞營養(yǎng)作用，早期使用胰島素能延緩或阻止糖尿病所致海馬形態(tài)學(xué)改變[12]。胰島素的每種生理功能都需要通過胰島素受體(InsR)，繼而經(jīng)由不同的信號傳導(dǎo)通路來發(fā)揮作用。InsR是酪氨酸激酶，它的許多作用都需要其輔助分子即胰島素受體底物(IRS)的參與。IRS是受體后信號傳導(dǎo)蛋白，可與下游蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用而將胰島素信號傳導(dǎo)到相關(guān)基因，從而介導(dǎo)胰島素的不同功能。IRS蛋白質(zhì)家族包括IRS-1～4和IRS p53，他們都具有類似的結(jié)構(gòu)，但不同的IRS其分布和功能是不同的，IRS-1在胰島素經(jīng)典的代謝作用中起主要作用[13]。本實驗研究免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示，糖脂清顆粒提高2型糖尿病模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能是通過提高IRS-1在海馬組織的表達、修復(fù)腦內(nèi)胰島素信號傳導(dǎo)通路實現(xiàn)的。

Morris水迷宮實驗是英國心理學(xué)家Morris于1981年設(shè)計并用于學(xué)習(xí)記憶腦機制研究的經(jīng)典動物行為學(xué)實驗，主要包括定位航行實驗和空間探索實驗2部分，其用于評價動物學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知能力，尤其是空間學(xué)習(xí)記憶功能(空間位置覺和方向覺)較為客觀而準(zhǔn)確的方法，還可將實驗動物的學(xué)習(xí)記憶功能障礙與感覺運動功能障礙等分開，客觀反映認(rèn)知功能[14]，近年來常用于阿爾茨海默病防治的研究。大鼠的學(xué)習(xí)記憶依賴于對信息的獲得和回憶的意識表達，依賴于評價、比較和推理等認(rèn)知過程，大鼠找到平臺的時間和策略反映了空間學(xué)習(xí)和記憶的能力[15]。本實驗應(yīng)用Morris水迷宮，觀察并探討糖脂清顆粒對大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響。水迷宮實驗結(jié)果說明，糖脂清顆?？梢蕴岣?型糖尿病模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，糖脂清顆粒能夠顯著降低2型糖尿病模型大鼠的空腹血糖水平，改善糖代謝，還可以提高2型糖尿病模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。其機制可能與改善2型糖尿病模型大鼠糖代謝，提高IRS-1在海馬組織的表達，修復(fù)腦內(nèi)胰島素信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。

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