大粒車前子麩殼多糖的分離純化及部分理化性質(zhì)

施曉丹，林慧霞，殷軍藝，聶少平,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.廈門華廈職業(yè)學(xué)院，福建 廈門 361000）

大粒車前子麩殼多糖的分離純化及部分理化性質(zhì)

施曉丹1，林慧霞2，殷軍藝1，聶少平1,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.廈門華廈職業(yè)學(xué)院，福建 廈門 361000）

以大粒車前子麩殼為研究對象，提取水溶性多糖組分并對其部分理化性質(zhì)進(jìn)行分析。車前子麩殼水提粗多糖經(jīng)過SephacrylTMS-400 HR葡聚糖凝膠柱得到純化的多糖組分（polysaccharide from bran of Plantago asiatica L.，PBPL）。結(jié)果顯示：PBPL為均一多糖，平均分子質(zhì)量為619 651 D，糖含量、蛋白質(zhì)含量和糖醛酸含量依次為（71.420±0.007）%、（6.07±0.02）%、（20.74±0.05）%。PBPL含有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖5 種單糖，物質(zhì)的量比為2.24∶1.87∶1.00∶3.24∶3.49，糖醛酸主要是半乳糖醛酸。紅外光譜中有多糖、蛋白、糖醛酸以及β-吡喃糖環(huán)特征吸收峰。

大粒車前子麩殼；多糖；理化性質(zhì)

在我國，車前子被定義為大粒車前（Plantago asiatica L.）或平車前（P. depressa Willd）的干燥成熟種子[1]，是我國傳統(tǒng)中醫(yī)用藥之一[2]。2012年國家食品藥品監(jiān)督管理總局將其列為可用于保健食品的物品[3]，其活性成分主要包括苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜類、黃酮以及多糖等[4-5]。車前子多糖是車前子種皮外表細(xì)胞壁中的黏液質(zhì)，又被稱為車前子膠，早在20世紀(jì)50年代左右，Laidlaw等[6-7]就報(bào)道了水提卵葉車前子膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地來源的車前子多糖都是高度支鏈化的阿拉伯木聚糖[8-10]，并具有免疫調(diào)節(jié)[11]、降血糖[12]、降血脂[13]以及降低膽固醇[14]等多種生物活性。由于膳食纖維含量很高，目前車前子已被開發(fā)成代餐粉，幫助人們瘦身減肥、調(diào)節(jié)便秘，或作為食品添加劑添加到冰激凌等食品中，改善食品品質(zhì)。

車前子麩殼是車前子的外殼而非種皮部分，一般在車前子采收后，其麩殼都被浪費(fèi)，棄之不用，關(guān)于其多糖的研究更是未見報(bào)道。因此，在車前子多糖研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以車前子麩殼作為研究對象，采用傳統(tǒng)的水提醇沉法提取多糖，并對所得成分進(jìn)行分離純化，同時(shí)分析其部分理化性質(zhì)，旨在為車前子麩殼多糖的結(jié)構(gòu)和功能的深入研究提供參考，同時(shí)為車前子麩殼資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大粒車前子麩殼，產(chǎn)自江西吉安。

葡聚糖凝膠填料 美國Amersham Biosciences公司；葡萄糖 美國Sigma公司；鼠李糖、L-巖藻糖、D-核糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、濃硫酸、石油醚 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀（光譜純）、考馬斯亮藍(lán)G-250（進(jìn)口分裝） 德國Fluka公司；牛血清白蛋白 美國Amersco公司；三氟乙酸 阿拉丁試劑有限公司；無水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮 西隴化工股份有限公司；以上試劑至少為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SephacrylTMS-400 HR凝膠柱（2.6 cm×60 cm，50 μm）上海廈美生化科技有限公司；Agilent 6890氣相色譜儀美國Agilent Technologies 公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；高效液相色譜儀 美國Waters公司；Nicolet FT-IR 5700型傅立葉紅外光譜儀 美國Thermo Electron公司；ALPHA 1-2冷凍干燥機(jī) 德國Martin Christ公司；AL 104 型電子天平上海梅特勒-托利多儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 車前子麩殼精制多糖的制備

稱取干燥的車前子麩殼500 g，加入石油醚（沸程60～90 ℃）4 000 mL，常溫下浸提24 h進(jìn)行脫脂。過濾，揮發(fā)去除溶劑后加80%乙醇4 000 mL浸泡1 d，過濾，濾渣于50 ℃烘箱中揮發(fā)去除乙醇。干燥后，加5 000 mL 蒸餾水，沸水浴提取2 h，離心分離（4 800 r/min，10 min），過濾，濾渣重復(fù)提取2 次，合并濾液，真空濃縮，加入80%乙醇后于4 ℃醇沉過夜，再次離心分離，冷凍干燥得車前子麩殼水提物。將所得水提物復(fù)溶于水，采用Sevag法（氯仿-正丁醇（4∶1，V/V））反復(fù)脫蛋白，然后用流動自來水透析48 h，蒸餾水透析24 h，透析液真空濃縮后緩慢加入95%食用級或無水乙醇（終體積分?jǐn)?shù)為80%），于4 ℃冰箱中醇沉過夜后離心分離，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚各洗兩次，冷凍干燥得大粒車前子麩殼水提粗多糖（crude polysaccharide from bran of Plantago asiatica L.，CPBPL），稱質(zhì)量，備用。

1.3.2 車前子麩殼水提多糖的純化

參照文獻(xiàn)[15]中車前子多糖的純化方法，將所得的CPBPL用超純水配制成4 mg/mL的溶液，用0.8 μm濾膜過濾，采用SephacrylTMS-400 HR葡聚糖凝膠柱對所得的CPBPL進(jìn)行分離純化。苯酚-硫酸法跟蹤監(jiān)測得到多糖洗脫曲線。實(shí)驗(yàn)以0.15 mol/L NaCl溶液為流動相，流速為1.2 mL/min，進(jìn)樣體積為3 mL。將收集的多糖組分濃縮凍干得大粒車前子麩殼多糖（PBPL）。

1.3.3 純度及平均分子質(zhì)量的測定

采用高效凝膠滲透色譜法測定PBPL的 純度及平均分子質(zhì)量[15]。色譜柱為UltrahydrogelTMLinear凝膠柱（7.8 mm×300 mm，10 μm）；流動相為水，流速為0.6 mL/min；示差檢測器；柱溫保持在35 ℃；進(jìn)樣量為20 μL。以葡萄糖、Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500和藍(lán)色葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品分配系數(shù)為y軸，以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=－0.236 9 lgx+1.547 8，R2= 0.994 1。相同條件下測定PBPL的保留時(shí)間，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得PBPL的平均分子質(zhì)量。

1.3.4 化學(xué)成分分析

采用苯酚-硫酸法[16]，以葡萄糖和半乳糖的混合溶液為標(biāo)準(zhǔn)，測定總糖含量。采用考馬斯亮藍(lán)法[17]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，測定蛋白質(zhì)含量。采用硫酸-咔唑法[18]，以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)測定糖醛酸含量。

1.3.5 PBPL單糖組成分析

[19]的方法，稱取3.3 mg PBPL于安瓿管中，加入2 mL濃度為2 mol/L的三氟乙酸，真空封管，然后置于烘箱中，于100 ℃反應(yīng)12 h，反應(yīng)完成后冷卻至室溫，70 ℃水浴揮發(fā)去除N2，得到水解后的單糖混合物，然后將水解得到的單糖混合物衍生為糖腈乙酸酯，反應(yīng)產(chǎn)物可直接進(jìn)樣，用氣相色譜（gas chromatography，GC）分析。

色譜條件：采用DB1701石英毛細(xì)管柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm），固定液為SE-54；載氣為氮?dú)?，進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃，升溫程序：170 ℃保持2 min，以10 ℃/min 升至250 ℃，維持20 min；色譜柱溫：250 ℃；檢測器：FID檢測器；分流比：20∶1。

1.3.6 PBPL糖醛酸組成分析

采用碳化二亞胺[20-21]對PBPL進(jìn)行反復(fù)還原3 次，硫酸-咔唑法檢測為陰性后，冷凍干燥，將還原后的樣品記為PBPL-R。所得的還原產(chǎn)物采用氣相色譜法分析其單糖組成，通過對比羧基還原前后中性糖的變化推測出糖醛酸的組成。

1.3.7 紅外光譜分析

取適量樣品，用KBr壓片，采集PBPL的紅外光譜信號，波數(shù)掃描范圍為400～4 000 cm－1，然后對光譜圖進(jìn)行分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 車前子麩殼多糖純度及平均分子質(zhì)量

圖1 大粒車前子麩殼水提粗多糖純化洗脫曲線Fig.1 Elution curve of water extractable crude polysaccharide from Plantago asiatica L. bran

根據(jù)1.3.1節(jié)方法制備得到的CPBPL得率約為5%，少于前期報(bào)道的車前子多糖最高得率（13.79%）的一半[15]。多糖的分子大小和形狀不同，在凝膠柱中的洗脫速率也不同，大分子質(zhì)量的多糖先洗脫出來，小分子質(zhì)量的多糖后被洗脫出來。圖1是CPBPL的洗脫曲線，為單一對稱峰，可見其純度較高。

圖2 PBPL的示差色譜圖Fig.2 Differential chromatogram of PBPL with RI detection

由圖2可知，高效凝膠滲透色譜峰為均勻?qū)ΨQ單一峰，即經(jīng)葡聚糖凝膠柱純化后所得多糖PBPL為均一多糖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到PBPL平均分子質(zhì)量為619 651 D。

2.2 車前子麩殼多糖化學(xué)成分分析

表1 PBPL 化學(xué)組成分析（±s，n＝3）Table1 Chemical composition of PBPL (±s,n=3)

表1 PBPL 化學(xué)組成分析（±s，n＝3）Table1 Chemical composition of PBPL (±s,n=3)

樣品名糖含量/%蛋白質(zhì)含量/%糖醛酸含量/% PBPL71.420±0.0076.07±0.0220.74±0.05

由表1可知，與同樣方法制備的車前子多糖的理化指標(biāo)（糖含量87.3%，蛋白質(zhì)含量1.2%，糖醛酸含量14.7%）[12]相比，車前子麩殼多糖的糖含量相對較低，而蛋白質(zhì)和糖醛酸含量比較高，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與多糖形成糖蛋白復(fù)合物，用Sevag法很難完全清除[23]。

2.3 單糖及糖醛酸組成分析

表2 PBPL單糖以及糖醛酸組成物質(zhì)的量比Table2 Molar ratio of monosaccharide and uronic acid compositions of PBPL

由表2可知，PBPL主要由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖5 種單糖構(gòu)成，其中葡萄糖和半乳糖為主要成分。另外，多糖經(jīng)過糖醛酸還原后，半乳糖的含量明顯增加，其他單糖含量基本保持不變，由此推測出其中部分半乳糖是由半乳糖醛酸轉(zhuǎn)化而來的。

目前研究報(bào)道的卵葉車前子中提取的多糖則是以吡喃型木聚糖為主鏈，同時(shí)連有3%～5%的鼠李糖殘基、5%～8%的半乳糖醛酸的高度支化的阿拉伯木聚糖[9,24-25]。另外，大粒車前子多糖PLP-2也主要由阿拉伯糖和木糖組成，還有少量的鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，但PLP-2的主要糖醛酸為葡萄糖醛酸[26]。由此可見，PBPL與車前子多糖的化學(xué)組成存在很大差別。

2.4 紅外光譜掃描結(jié)果

紅外光譜法是鑒定化合物和測定分子結(jié)構(gòu)最有用的方法之一，該測試方法所需樣品少，非常適合于測定樣品得率低的多糖分子結(jié)構(gòu)。PBPL的紅外光譜如圖3所示，在3 600～3 000 cm－1之間出現(xiàn)的寬而強(qiáng)的吸收峰推測為糖類中的O—H伸縮振動形成的，在2 934.5 cm－1左右出現(xiàn)的弱吸收峰推測為甲基或亞甲基的C—H伸縮振動，而1 400～1 200 cm－1之間的一組峰推測為糖類的C—H變角振動，在1 650～1 600 cm－1之間應(yīng)該有糖環(huán)的伸縮振動；由此可初步確定該化合物為糖類物質(zhì)[27]。

圖3 PBPL的紅外光譜圖Fig.3 IR Spectrum of PBPL

在1 611 cm－1處附近尖而強(qiáng)的吸收峰推測為C=O的伸縮振動形成的，而在1 413.6 cm－1處應(yīng)該是N—H的變角振動，這證明有蛋白質(zhì)存在。1 248.8 cm－1處吸收峰為COOH中O—H的變角振動，由此可以判斷車前子麩殼多糖中含有—CHO和—COOH，這也驗(yàn)證了車前子多糖中含有糖醛酸。另外，1 049.5 cm－1處的吸收峰表明PBPL含有吡喃糖環(huán)，919.0 cm－1處的弱吸收峰為β-吡喃糖環(huán)的非對稱伸縮振動所形成的[21,28]。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)分離純化得到大粒車前子麩殼多糖，并對其部分理化性質(zhì)作了分析。結(jié)果表明，PBPL的平均分子質(zhì)量為619 651 D，所得組分中糖含量較高（約71%），同時(shí)含有較高含量的糖醛酸和少量蛋白質(zhì)。單糖組成分析顯示，PBPL主要含有葡萄糖和半乳糖，共占60%以上，此外還含有鼠李糖、阿拉伯糖和甘露糖。其糖醛酸主要是半乳糖醛酸。紅外光譜分析顯示PBPL具備多糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)以及β-吡喃糖環(huán)的特征吸收峰。PBPL在化學(xué)成分以及結(jié)構(gòu)組成方面與所報(bào)道的車前子多糖相比具有很大的差異，是一種新的多糖組分，所以有必要進(jìn)一步對PBPL的結(jié)構(gòu)及活性進(jìn)行深入研究，為大粒車前子麩殼資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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Isolation, Purification and Partial Physico-chemical Properties of Polysaccharide from Bran of Plantago asiatica L.

SHI Xiao-dan1, LIN Hui-xia2, YIN Jun-yi1, NIE Shao-ping1,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. Xiamen Huaxia Vocational College, Xiamen 361000, China)

A polysaccharide fraction, PBPL, purif ed from Plantago asiatica L. bran was characterized for physico-chemical properties. It was extracted with hot water and purif ed by SephacrylTMS-400 HR chromatographic column. The relative average molecular weight determined by high performance gel permeation chromatography (HPGPC) was 619 651 D. The results showed that PBPL contained (71.420 ± 0.007)% of total sugar, (6.07 ± 0.02)% of protein and (20.74 ± 0.05)% of uronic acid by a colorimetric method. Rhamnose, arabinose, mannose, glucose and galactose were found to be the compositional monosaccharides at a molar ratio of 2.24:1.87:1.00:3.24:3.49 in PBPL using gas chromatography (GC). After reduction, galacturonic acid was conf rmed to be the major component of uronic acid. As shown by infrared spectral (IR) analysis, PBPL had characteristic absorption peaks of polysaccharide, protein and uronic acid and β-pyranose ring.

Plantago asiatica L. bran; polysaccharide; physico-chemical properties

O652.4；R284.2

A

1002-6630（2014）23-0039-04

10.7506/ spkx1002-6630-201423008

2014-06-18

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102102）；江西省高等學(xué)?？萍悸涞赜?jì)劃項(xiàng)目（KJLD13004）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301434）；2013年度高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20133601120009）

施曉丹（1990—），女，碩士研究生，主要從事食物（含生物質(zhì)）資源開發(fā)與利用研究。E-mail：ncuskshixiaodan@163.com

*通信作者：聶少平（1978—），男，教授，博士，主要從事食品化學(xué)與分析、食品營養(yǎng)與安全、復(fù)雜碳水化合物研究。E-mail：spnie@ncu.edu.cn