終末期腎臟病患者橈動脈中膜鈣化與核心結合因子α1及Ⅰ型膠原的關系研究

張俊霞，徐金升，靳晶晶，白亞玲，張勝雷，崔立文，張慧然

心血管疾病是終末期腎臟病(end stage renal disease,ESRD)患者的首位死亡原因，研究顯示血管鈣化尤其中膜鈣化是ESRD患者心血管疾病的重要病因[1]。因此，深入了解血管鈣化，對降低ESRD患者心血管疾病發(fā)病率，提高其生存率有重要意義。近年來發(fā)現，血管鈣化是一個以血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型轉化為特征的細胞介導的主動調節(jié)過程。有前期體外實驗研究發(fā)現，ESRD患者血清可使大鼠VSMCs 核心結合因子α1(Cbfα1)表達升高，Ⅰ型膠原分泌增加[2]，提示ESRD患者血清可刺激VSMCs發(fā)生表型轉化進而導致鈣化。但ESRD患者體內血管鈣化的發(fā)生機制和確切病因尚不清楚。因橈動脈屬于中動脈，對其鈣化特點和機制的研究可在一定程度上反映ESRD患者心、腦等中動脈的情況，為此本研究測定了ESRD患者橈動脈中膜鈣化及Cbfα1和Ⅰ型膠原的表達情況，旨在探討橈動脈中膜鈣化與Cbfα1和Ⅰ型膠原的關系，為尋求新的早期防治血管鈣化的靶點提供參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2009年5月—2012年12月在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院腎內科住院初次行前臂動-靜脈內瘺成形術的ESRD患者62例，其中男38例，女24例；年齡18～81歲，平均(51.6±14.9)歲；原發(fā)病：慢性腎小球腎炎15例,糖尿病腎病10例,高血壓腎病7例,IgA腎病6例，多囊腎3例,梗阻性腎病2例,多發(fā)性骨髓瘤1例，馬兜鈴酸腎病1例，其他17例。納入標準：(1)年齡≥18歲者；(2)確診為慢性腎衰竭(尿毒癥期)，符合我國及美國腎臟基金會(K-DOQI)對慢性腎臟病分期為ESRD的診斷標準[3-4]者；(3)尚未開始腎臟替代治療或腎臟替代治療<2周者；(4)意識清楚，自愿參與本研究，并簽署知情同意書者。排除標準：(1)入院前已經存在嚴重肝臟疾病、惡性腫瘤、原發(fā)性甲狀旁腺功能亢進或減退癥以及近期存在急性炎癥疾病者；(2)已參與其他臨床試驗者。以上均經過本院倫理委員會論證。

1.2 研究方法

1.2.1 標本采集 所有患者行前臂動-靜脈內瘺成形術時留取修剪的橈動脈管壁，避免損傷內膜和管壁,10%中性甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋。

1.2.2 臨床指標檢測 患者初次行前臂動-靜脈內瘺成形術之前(尚未行血液透析時)均測定空腹血清鈣(Ca)、血清磷(P)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、血紅蛋白(Hb)、堿性磷酸酶(ALP)、鐵蛋白、甲狀旁腺素(iPTH)和C反應蛋白(CRP)；測量血壓；計算體質指數(BMI)。

1.2.3 橈動脈組織學分析

1.2.3.1 鈣鹽沉積染色 采用Von Kossa染色法將留取的橈動脈組織進行鈣鹽沉積染色。方法：5%硝酸銀溶液避光浸染30 min，再經紫外線照射30 min,伊紅復染后脫水、封片。鏡下黑色為陽性染色。

1.2.3.2 Cbfα1及Ⅰ型膠原表達的測定 采用免疫組織化學法測定橈動脈管壁Cbfα1及Ⅰ型膠原的表達。方法：切片常規(guī)脫蠟，逐級乙醇溶液水化，3%過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶，加一抗山羊抗人I型膠原(1∶200)、山羊抗人Cbfα1(1∶100)(武漢博士德生物工程有限公司)，均置于4 ℃冰箱孵育過夜；二抗室溫孵育 30 min ；二氨基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染后脫水、透明、封片。鏡下棕黃色為陽性染色。

1.2.4 染色結果判定

1.2.4.1 鈣鹽沉積染色 鈣鹽沉積分為0～4級。0級:無鈣鹽沉積；1級:點狀沉積；2級:單個片狀沉積；3級:多個片狀沉積；4級:彌漫性圍繞管腔沉積。用von Kossa染片每個標本8張,組織鈣化積分取其平均值,并根據組織鈣化積分將患者分為無鈣化組和鈣化組，積分<1.0分納入無鈣化組；1.0～4.0分納入鈣化組，其中1.0～2.5分為輕中度鈣化，>2.5～4.0分為重度鈣化。

1.2.4.2 免疫組織化學染色 采用半定量法，根據陽性細胞數比例分為4級：≤24%，0分；25%～50%，1分；51%～74%，2分；≥75%，3分。根據染色強度分為4級：陰性，0分；淡黃色，1分；黃色，2分；棕黃色，3分。陽性表達積分為陽性細胞數評分和染色強度評分之和，為0～6分。

2 結果

2.1 ESRD患者橈動脈血管鈣化情況 鈣鹽沉積染色顯示，62例ESRD患者橈動脈標本中25例發(fā)生血管鈣化，發(fā)生率為40.3%，其中輕中度鈣化22例(35.5%)，重度鈣化3例(4.8%)，均發(fā)生在血管中膜(見圖1)。

注：圖A無鈣化；圖B輕中度鈣化；圖C重度鈣化；箭頭所指為鈣化

圖1 ESRD患者橈動脈血管鈣化情況(Von Kossa染色，×100)

Figure1 Radial artery calcification in ESRD patients

2.2 ESRD患者橈動脈Cbfα1及Ⅰ型膠原的表達情況 根據組織鈣化積分，無鈣化組37例，鈣化組25例。鈣化組橈動脈中膜均有Cbfα1及Ⅰ型膠原的陽性表達；無鈣化組橈動脈中膜31例(83.8%)Cbfα1陽性表達，19例(51.4%)Ⅰ型膠原陽性表達(見圖2)。鈣化組Cbfα1及Ⅰ型膠原的陽性表達積分均高于無鈣化組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1)。

2.3 兩組ESRD患者臨床指標的比較 鈣化組與無鈣化組的年齡、BMI、血壓、Ca、iPTH、TG、TC、LDL、HDL、Hb、CRP、鐵蛋白、ALP比較，差異無統計學意義(P>0.05)。鈣化組血清P水平高于無鈣化組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2)。

注：A圖 Cbfα1陽性表達；B圖 Cbfα1陰性表達；C圖 Ⅰ型膠原陽性表達；D圖 Ⅰ型膠原陰性表達

圖2 ESRD患者橈動脈Cbfα1及Ⅰ型膠原的表達情況(免疫組織化學染色，×200)

Figure2 The expression of Cbfα1and collagen I of radial arteries in patients with ESRD

表1 兩組橈動脈Cbfα1及Ⅰ型膠原陽性表達積分的比較〔M(QR)〕

Table1 Comparison of Cbfα1and collagen I expression of integral between the two groups

組別例數Cbfα1Ⅰ型膠原無鈣化組3730(60)05(30)鈣化組2545(30)10(20)Z值-2516-3750P值 0012 0000

注：Cbfα1=核心結合因子α1

2.4 鈣化組 Cbfα1及Ⅰ型膠原陽性表達積分與臨床指標的關系 Cbfα1陽性表達積分與血清P呈正相關(P<0.05)，與年齡、BMI、血壓、血清Ca、TG、TC、LDL、HDL、iPTH、Hb、CRP、鐵蛋白、ALP無相關性(P>0.05)。Ⅰ型膠原陽性表達積分與血清P呈正相關(P<0.05)，與年齡、BMI、血壓、血清Ca、TG、TC、LDL、HDL、iPTH、Hb、CRP、鐵蛋白、ALP無相關性(P>0.05，見表3)。Cbfα1陽性表達積分與Ⅰ型膠原陽性表達積分呈正相關(r=0.307,P<0.05)。

3 討論

流行病學研究表明，ESRD人群心血管疾病病死率至少是普通人群的10倍[5]，而血管鈣化是ESRD患者常見并發(fā)癥，其作為ESRD患者死亡風險的獨立預測因子[6-7]，已經受到人們的廣泛關注。研究表明，ESRD患者血管鈣化常見于血管中膜平滑肌層[8]。與血管內膜鈣化不同，血管中膜鈣化主要增加血管僵硬度、降低血管順應性，損害血管舒張功能，從而導致心律失常和猝死。橈動脈與心、腦血管同屬中等肌性動脈，對其進行研究有助于早期防治心、腦等中動脈血管鈣化，降低ESRD患者心血管疾病病死率。本研究發(fā)現，ESRD患者不同程度的橈動脈鈣化發(fā)生率為40.3%，與近期Freercks等[9]報道相近；且主要發(fā)生在血管中膜，提示ESRD患者血管中膜鈣化發(fā)生率較高，危害性較大。

表2 兩組ESRD患者臨床指標的比較

注：BMI=體質指數，Ca=鈣，P=磷，iPTH=甲狀旁腺素，TG=三酰甘油，TC=總膽固醇，LDL=低密度脂蛋白，HDL=高密度脂蛋白，Hb=血紅蛋白，CRP=C反應蛋白，ALP=堿性磷酸酶；1 mm Hg=0.133 kPa

表3 鈣化組Cbfα1及Ⅰ型膠原陽性表達積分與臨床指標的關系

ESRD患者橈動脈中膜鈣化的機制尚不清楚，研究認為血管鈣化的主要機制之一是VSMCs發(fā)生表型轉化[10]。而VSMCs表型轉化是細胞嚴密調節(jié)下的轉化過程，其中骨源性轉錄因子Cbfα1是該過程的重要調節(jié)因子。Cbfα1是轉錄因子Runx家族成員之一，是成骨細胞分化和軟骨細胞成熟的必需因子[11-12]。在動物體內研究中，以特異性敲除血管平滑肌細胞Cbfα1基因的小鼠為模型，發(fā)現其可抑制氧化應激誘導的血管鈣化過程[13]。本研究結果顯示，橈動脈中膜鈣化組Cbfα1及Ⅰ型膠原的陽性表達積分均高于無鈣化組。 I型膠原作為細胞外基質的主要成分，約占血管壁膠原成分的60%，屬于“間隙膠原”，在血管鈣化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，與之前細胞實驗[2]相一致。本研究還發(fā)現，橈動脈血管中膜Cbfα1與Ⅰ型膠原的陽性表達積分呈正相關，這也與目前關于Cbfα1可以正向調節(jié)Ⅰ型膠原蛋白基因表達的研究相一致[14]。以上結果均提示Cbfα1、Ⅰ型膠原在ESRD患者橈動脈中膜鈣化中起著重要作用，Cbfα1可作為治療動脈中膜鈣化的一個潛在靶點。本研究結果顯示，在37例無鈣化的血管標本中，仍有31例Cbfα1表達陽性及19例I型膠原表達陽性，說明血管中膜骨特異性蛋白表達可能是血管鈣化的早期表現，進一步提示橈動脈中膜鈣化是細胞介導的主動過程。

為進一步探討誘導血管中膜VSMCs表型轉化的因素，本研究分析了兩組患者的臨床指標，結果發(fā)現鈣化組血清P水平高于非鈣化組；進一步相關分析顯示，血清P水平與Cbfα1及Ⅰ型膠原的陽性表達積分亦呈明顯正相關，與Li等[15]的體外實驗相一致。提示在ESRD患者中高磷血癥通過誘導中膜平滑肌細胞高表達Cbfα1，進而分泌I型膠原參與鈣化。但高血清P誘導VSMCs發(fā)生表型轉化的具體分子機制仍需進一步研究證實。

綜上所述，ESRD患者橈動脈中膜鈣化的發(fā)生率較高，其可能與高P誘導血管中膜VSMCs表型轉化，促使I型膠原表達增加有密切關系。Cbfα1作為VSMCs表型轉化的重要調節(jié)因子有望成為治療ESRD患者血管中膜鈣化的重要靶點。然而，本研究也有一定的局限性，如因橈動脈組織標本留取較為困難，所以納入研究的樣本量相對較少。因此今后還需擴大樣本量并設計基礎實驗進一步探討ESRD患者中膜鈣化的機制。

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