抗血小板治療對老年人血小板功能的影響及其環(huán)氧化酶1和環(huán)氧化酶2基因多態(tài)性研究

梁 輝，黃潔杰，周熙琳，王文安

血栓性疾病包括動脈血栓和靜脈血栓，是老年性疾病的病因之首及病死的重要原因。老年人容易出現(xiàn)血栓栓塞的原因是動脈發(fā)生粥樣硬化及斑塊脫落、血小板活化及血小板血栓形成，易導(dǎo)致心肌梗死、腦梗死等動脈血栓事件。抗血小板治療可減少心肌梗死、腦梗死等動脈血栓事件，但“藥物抵抗”常影響抗血小板治療療效。本研究選取具有血栓高危因素(如患有糖尿病、高脂血癥、高血壓等)或發(fā)生過動脈血栓事件(如腦梗死、心肌梗死等)而進(jìn)行抗血小板治療的老年患者為研究對象，檢測其血小板功能及環(huán)氧化酶1(COX-1)、環(huán)氧化酶2(COX-2)基因多態(tài)性(SNP)，以期為臨床抗血小板治療提供個體化干預(yù)指導(dǎo)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2011年1月—2012年12月在上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院住院的≥60歲且服用拜阿司匹林1年以上的患者114例，其中具有血栓高危因素者55例(高危組)，發(fā)生過動脈血栓事件者59例(血栓組)。高危組中男34例，女21例；年齡60～88歲；糖尿病19例，高脂血癥伴高血壓36例。血栓組中男36例，女23例；年齡61～85歲；單純性腦梗死22例、腔隙性腦梗死37例，單純性腦梗死和腔隙性腦梗死的診斷參照各類腦血管病診斷要點[1]；糖尿病25例，高脂血癥伴高血壓34例。另選取同期在本院行體檢健康者55例為對照組，其中男35例，女20例；年齡60～82歲；均無糖尿病、高脂血癥或高血壓，且從未服用過拜阿司匹林。3組受試者的性別、年齡具有均衡性。

1.2 方法

1.2.1 血小板計數(shù)(PLT)和血小板平均體積(MPV) 采用LH750全自動血液分析儀測定3組受試者PLT和MPV。

1.2.2 血栓彈力圖(TEG) 抽取每例受試者空腹靜脈血6 ml，其中3 ml用肝素抗凝，3 ml用0.109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝，在2 h內(nèi)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行TEG檢查，所用儀器為美國Haemoscope Corp公司TEG-5000血栓彈力儀，測定出血栓最大幅度后再描記30 min后停機；記錄血栓最大堅固度(TEG-MA)和花生四烯酸誘導(dǎo)的血小板抑制率(TEG-AA)。前者與血小板質(zhì)、量和纖維蛋白原水平有關(guān)，花生四烯酸(AA)購自Chronolog公司，濃度為0.5 mg/L。TEG-AA≤20%為阿司匹林抵抗(AR)，20%

1.2.3 SNP 抽取每例受試者全血300 μl，按血液Wizard基因組DNA純化試劑盒(promega公司生產(chǎn))說明書提取基因組DNA，在260 nm、280 nm紫外分光光度儀下檢測DNA吸光度，進(jìn)行濃度和純度鑒定；PCR反應(yīng)引物序列見表1。采用50 μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴增：DNA模版1.0 μl、上游引物和下游引物各1.0 μl、10 mmol/L dNTP 1.0 μl、去離子水36.3 μl、Taq酶2.5 μl、緩沖液5.0 μl；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 30 s、55～60 ℃ 35 s、72 ℃ 40～50 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步鑒定，測序由上海生工生物工程有限公司完成。

表1 PCR反應(yīng)引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

注：COX-1=環(huán)氧化酶1，COX-2=環(huán)氧化酶2

2 結(jié)果

2.1 PLT、MPV和TEG-MA 3組受試者PLT比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3組受試者M(jìn)PV、TEG-MA比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中血栓組MPV、TEG-MA均大于高危組和對照組，高危組TEG-MA大于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 3組受試者PLT、MPV和TEG-MA比較Table 2 Comparison of PLT，MPV and TEG-MA in the three groups

注：PLT=血小板計數(shù)，MPV=血小板平均體積，TEG-MA=血栓最大堅固度；與對照組比較，*P<0.05；與高危組比較，△P<0.05

2.2 TEG-AA 對照組AR 1例、ASR 3例、AS 51例，TEG-AA為(78.7±15.0)%；高危組AR 6例、ASR 12例、AS 37例，TEG-AA為(64.2±23.7)%；血栓組AR 19例、ASR 25例、AS 15例，TEG-AA為(32.5±19.4)%。3組受試者TEG-AA比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=86.250，P<0.05)；且血栓組低于高危組，高危組低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 SNP檢測結(jié)果

2.3.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗 根據(jù)TEG-AA將所有受試者分為NAS組66例和AS組103例，Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果顯示，NAS組和AS組COX-1基因-1676A>G位點和COX-2基因-765 G>C位點SNP具有群體代表性。PCR擴增產(chǎn)物直接測序結(jié)果見圖1～2。

2.3.2 COX-1基因-1676A>G位點基因型和等位基因分布 NAS組和AS組COX-1基因-1676A>G位點基因型和等位基因頻率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

2.3.3 COX-2基因-765G>C位點基因型和等位基因分布 NAS組和AS組COX-2基因-765G>C位點基因型和等位基因頻率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表4)。

注：A為野生型AA基因型，B為雜合子AG基因型，C為突變純合子GG基因型；顏色加深處為SNP位點

圖1 COX-1基因-1676A>G位點PCR擴增產(chǎn)物直接測序結(jié)果

Figure1 Directly sequenced result of PCR amplified product of COX-1-1676A>G

注：A為野生型GG基因型，B為雜合子GC基因型；顏色加深處為SNP位點

圖2 COX-2基因-765G>C位點PCR擴增產(chǎn)物直接測序結(jié)果

Figure2 Directly sequenced result of PCR amplified product of COX-2-765G>C

表3 NAS組和AS組COX-1基因-1676A>G位點基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table3 Comparison of genetypes and allele frequency of COX-1-1676A>G between NAS group and AS group

組別例數(shù)基因型AA AG GG等位基因A GNAS組6613(19 7)40(60 6)13(19 7) 66(50 0) 66(50 0)AS組10340(38 8)53(51 5)10(9 7)133(64 6)73(35 4)χ2值8 2587 047P值0 0160 008

表4 NAS組和AS組COX-2基因-765G>C位點基因型和等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table4 Comparison of genetypes and allele frequency of COX-2-765 G>C between NAS group and AS group

組別例數(shù)基因型GG CG等位基因G CNAS組6658(87 9)8(12 1)124(93 9)8(6 1)AS組10398(95 1)5(4 9)201(97 6)5(2 4)χ2值2 9922 872P值0 0840 090

3 討論

老年人血栓形成的幾率是兒童和青少年的數(shù)百倍至一千倍，早期預(yù)防和早期干預(yù)尤為重要[3]。老年人容易出現(xiàn)血栓的原因是由于動脈粥樣硬化及斑塊脫落而造成血管內(nèi)皮細(xì)胞下膠原暴露、血小板活化，最后形成血小板血栓，繼而導(dǎo)致心肌梗死、腦梗死等動脈血栓事件[4]?？寡“逅幬镉糜谥委焺用}粥樣硬化斑塊造成的血栓已有幾十年的歷史，最常用藥物為阻斷AA途徑的阿司匹林。研究表明，阿司匹林用于高危心腦血管疾病患者可分別使動脈血栓事件發(fā)生率(心肌梗死或腦梗死)降低25%，冠狀動脈旁路移植術(shù)及動脈栓塞事件發(fā)生率降低48%，肺栓塞發(fā)生率降低67%，深靜脈血栓形成發(fā)生率降低23%[5]。但研究者在實際臨床工作中發(fā)現(xiàn)，固定劑量的阿司匹林隨著用藥時間的推移有些個體可出現(xiàn)AR現(xiàn)象，導(dǎo)致“再?！?，且多見于年齡偏大患者[6]。如何預(yù)測服用阿司匹林患者是否出現(xiàn)AR及哪些因素容易引起AR是臨床醫(yī)生關(guān)注的重要問題。因此，本研究選取具有血栓高危因素或發(fā)生過動脈血栓事件而進(jìn)行抗血小板治療的老年患者為研究對象，檢測其血小板功能及COX-1、COX-2的SNP，以了解AR情況，決定是否需要更改治療方案，為臨床抗血小板治療提供個體化干預(yù)指導(dǎo)。

機體在正常情況下，血管內(nèi)血小板處于循環(huán)狀態(tài)，但在血栓形成的過程中，由于血管內(nèi)皮損傷、內(nèi)皮下膠原纖維暴露而導(dǎo)致流經(jīng)此處的血小板黏附、聚集、激活，血小板不斷消耗，PLT相應(yīng)地減少，同時血液系統(tǒng)通過反饋機制激活巨核細(xì)胞，產(chǎn)生大體積血小板，MPV相應(yīng)地增大。大體積血小板致密顆粒多、酶活力高、功能活躍、聚集及黏附能力增強，容易導(dǎo)致血栓形成[7]。因此，PLT是反映血小板生成與衰老的指標(biāo)，MPV是反映巨核細(xì)胞增生和血小板生成的指標(biāo)。TEG-MA是反映PLT和纖維蛋白原相互作用的指標(biāo)，其中PLT的作用約占80%，因此TEG-MA主要反映血小板的聚集功能[8]。本研究結(jié)果顯示，3組受試者PLT無明顯差異，血栓組MPV、TEG-MA均大于高危組和對照組，高危組TEG-MA大于對照組，提示具有血栓高危因素或發(fā)生過動脈血栓事件而進(jìn)行抗血小板治療的老年患者巨核細(xì)胞被激活，產(chǎn)生了大體積血小板，導(dǎo)致血小板聚集、黏附能力增強。本研究通過計算TEG-AA發(fā)現(xiàn)，對照組AR 1例、ASR 3例、AS 51例，TEG-AA為(78.7±15.0)%；高危組AR 6例、ASR 12例、AS 37例，TEG-AA為(64.2±23.7)%；血栓組AR 19例、ASR 25例、AS 15例，TEG-AA為(32.5±19.4)%。血栓組TEG-AA低于高危組，高危組TEG-AA低于對照組。提示具有高危血栓因素或發(fā)生過動脈血栓事件而進(jìn)行抗血小板治療的老年患者存在AR現(xiàn)象，需要調(diào)整抗血小板治療方案以預(yù)防突發(fā)性動脈血栓事件，而采用阿司匹林抗血小板治療仍有發(fā)生動脈血栓事件的可能，這部分患者應(yīng)判為“阿司匹林治療失敗”。心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展是多種危險因素共同作用的結(jié)果，在血栓形成過程中，血小板活性增強是重要因素，但不是惟一因素，凝血因子的活化也是血液呈高凝狀態(tài)的重要原因。Kulshrestha等[9]研究表明，腦血管疾病的發(fā)生與高血壓、糖尿病等密切相關(guān)，血小板的數(shù)量、質(zhì)量、形態(tài)改變與凝血因子的活化密切相關(guān)。

本研究根據(jù)TEG-AA將所有受試者分為NAS組66例和AS組103例，探討老年人COX-1和COX-2的SNP。研究結(jié)果顯示，NAS組和AS組COX-1基因-1676A>G位點基因型和等位基因頻率間均有明顯差異，而NAS組和AS組COX-2基因-765G>C位點基因型和等位基因頻率均無明顯差異。COX-1存在于大多數(shù)組織細(xì)胞中，是AA轉(zhuǎn)化為前列腺素G和前列腺素H途徑的第一個酶，阿司匹林通過使COX-1絲氨酸530位不可逆地乙?；钄嘌ㄋ谹2(TXA2)的合成，進(jìn)而發(fā)揮抗血栓作用。目前國內(nèi)外關(guān)于COX-1 SNP的研究主要集中于-842A>G、50C>T、22C>T、644C>A位點等。Fan等[10]研究首次證實COX-1基因-1676A>G位點SNP與中國漢族老年人群AR相關(guān)，本研究結(jié)果與之一致，證明了COX-1基因-1676A>G多位點SNP與老年人AR相關(guān)。機體在正常情況下，COX-2只在部分細(xì)胞低表達(dá)，只有受到炎癥等刺激后才會在平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血小板中表達(dá)增加。阿司匹林對COX-1的抑制作用較COX-2約強170倍，COX-2可能是AR的另一個重要原因[11]。研究表明,COX-2基因-765 G>C位點中攜帶C等位基因者更易發(fā)生AR，AR患者COX-2基因-765G>C位點基因變異率較AS患者明顯升高[12-13]，但也有研究表明COX-2基因-765G>C位點SNP與AR無關(guān)[14-15]，本研究亦未發(fā)現(xiàn)COX-2基因-765G>C位點SNP與AR之間的相關(guān)性，分析其原因可能與地區(qū)和種族差異有關(guān)。

綜上所述，血小板活性增強是血栓形成的重要原因，具有高危血栓因素或發(fā)生過動脈血栓事件而進(jìn)行抗血小板治療的老年患者存在AR現(xiàn)象，需注意調(diào)整抗血小板治療方案；COX-1基因-1676A>G位點SNP可能與AR有關(guān)，COX-2基因-765G>C位點SNP可能與AR無關(guān)。

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