益腎化濁解毒法對D-半乳糖致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶及氧化應(yīng)激的影響*

馬 濤，徐世軍，張允嶺△，王永炎

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 611137； 3.中國中醫(yī)科學(xué)院，北京 100700)

AD(Alzheimer’s disease)是老年期癡呆中最重要的形式，目前全球罹患老年癡呆患者達3500萬[1]。AD發(fā)病隱匿，進程緩慢，早期往往因未得到有效治療而使該病加重。AD患者后期語言能力喪失、人格變性，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。由于AD病程不可逆轉(zhuǎn)，后期幾無治愈可能，因此針對AD早期進行干預(yù)具有重要意義。大量現(xiàn)代研究表明，與線粒體損傷相關(guān)的氧化損傷是AD發(fā)病早期的重要病理事件[2]。中醫(yī)認(rèn)為，老年癡呆(AD)的病機是腎精虧虛、髓海不足、津液膏脂聚為痰濁，血行澀滯，痰瘀阻絡(luò)，絡(luò)病神傷[3]。

王永炎院士針對AD腎虛濁毒、損傷腦絡(luò)病機，運用益腎化濁解毒法治療AD，采用復(fù)方蓯蓉益智膠囊(FFCR)滋腎陰、化濁毒，補虛泄實，標(biāo)本兼治。本研究以D-半乳糖致癡呆小鼠為對象，研究益腎化濁法對亞急性衰老致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶及腦內(nèi)氧化應(yīng)激的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c雄性小鼠72只(3月齡)，體質(zhì)量(20±2) g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供(合格證號SCXK(京)2009-0007)。

1.2 藥物與試劑

D-半乳糖購自Sigma-Aldrich公司，復(fù)方蓯蓉益智膠囊(FFCR)由遼源譽隆亞東藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字Z20080047，生產(chǎn)批號1005070002)。陽性對照藥：安理申，衛(wèi)材(中國)藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字H20050978，生產(chǎn)批號120414A)。RIPA組織裂解液(批號20110315)、BCA蛋白測定試劑盒(批號20110205)購自普利萊基因技術(shù)有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(批號20110316)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試劑盒)(批號20110313)、丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號20110313)，8-羥基-2’-脫氧鳥苷(8-OHdG)抗體(J-1)(貨號sc-139586)購自Santa Cruz公司，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

SBA-2小鼠避暗程序自動控制儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，5810R臺式多功能高速冷凍離心機(Eppendorf公司)，UV3300 紫外可見分光光度計(上海美譜達公司)，F(xiàn)LX800酶標(biāo)儀(Biotex公司)。

1.4 動物分組及造模

3月齡雄性BALB/c小鼠72只，按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、模型組、安理申(陽性藥)組、FFCR高、中、低劑量組6組，每組12只。以正常小鼠為對照組，模型小鼠每天頸背皮下注射D-半乳糖 0.1 g/kg BW，連續(xù)注射50 d。

1.5 動物給藥

FFCR采用無菌水配制成0.08 g/mL、0.04 g/mL和0.02 g/mL混合液。安理申無菌水配制成0.1 mg/mL溶液。FFCR各組在模型組基礎(chǔ)上同時每天分別灌服1.2 g/kg BW、0.6 g/kg BW和0.3 g/kg BW的FFCR，陽性藥(安理申)組每天灌服1 mg/kg BW，正常組和模型組灌服同體積生理鹽水，連續(xù)灌胃50 d。

1.6 小鼠避暗實驗

小鼠給藥結(jié)束后進行避暗實驗。小鼠避暗反射箱分單獨5個箱，分為明暗兩室。反射箱通過數(shù)據(jù)線與電腦相連，由電腦控制。實驗時將小鼠頭部背對洞口放入明室，小鼠一進入暗室立即受到電擊，記錄小鼠放入明室至受到第一次電擊的時間(即潛伏期)和5 min內(nèi)進入暗室的錯誤次數(shù)，此為訓(xùn)練成績。24 h后重復(fù)測定，為測試成績。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

行為學(xué)測試結(jié)束后，選擇6只小鼠4%多聚甲醛灌注固定，取全腦放入4%多聚甲醛過夜，常規(guī)制備石蠟切片。小鼠腦組織石蠟切片精二甲苯脫蠟，0.01 mol/L PBS沖洗，微煮沸修復(fù)抗原，自然冷卻，PBS沖洗。5%山羊血清室溫孵育1 h，一抗(兔抗小鼠8-OhdG多克隆抗體)4℃濕盒孵育過夜。生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶200)室溫孵育2 h，0.05 mol/L Tris-Cl 充分漂洗，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化氫酶室溫孵育1 h，DAB顯色10 min，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片，光學(xué)顯微鏡(20倍物鏡)觀察形態(tài)學(xué)變化并采集圖像。

1.8 小鼠腦內(nèi)SOD、GSH-PX活性及MDA含量測定

行為學(xué)測試后，6只小鼠脫頸處死。取全腦稱重后，加入RIPA裂解液，采用玻璃勻漿器在冰上勻漿，4℃10000 rpm離心取上清。BCA法測定蛋白濃度。按試劑盒說明測定腦組織SOD、GSH-PX活性及MDA含量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方蓯蓉益智膠囊對D-半乳糖致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

表1顯示，模型小鼠給藥50 d后，避暗實驗結(jié)果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠進入暗箱的潛伏期明顯縮短(P<0.01)，而錯誤次數(shù)則顯著增加(P<0.05)，表明D-半乳糖對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力產(chǎn)生了明顯的損傷。與模型組比較，F(xiàn)FCR各組可顯著增加進入暗箱的潛伏期(P<0.05)，減少進入暗箱的錯誤次數(shù)(P<0.05)，并呈劑量依賴關(guān)系。其中高劑量FFCR可使模型小鼠避暗實驗潛伏期增加352.20%，錯誤次數(shù)減少60.14%。FFCR各組可顯著減少小鼠進入暗室的錯誤次數(shù)(P<0.05)。結(jié)果表明，F(xiàn)FCR可顯著改善D-半乳糖對小鼠腦學(xué)習(xí)記憶功能損傷，且總體改善效果優(yōu)于陽性對照藥安理申。

表1 復(fù)方蓯蓉益智膠囊對D-半乳糖致癡呆小鼠避暗實驗潛伏期和錯誤次數(shù)的影響

注：與正常對照組比較：ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；與模型組比較：*P<0.05

2.2 復(fù)方蓯蓉益智膠囊對D-半乳糖致癡呆小鼠腦內(nèi)8-羥基-2’-脫氧鳥苷(8-OHdG)表達的影響

圖1顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞胞漿中8-OhdG表達顯著增高，表明D-半乳糖損傷神經(jīng)細(xì)胞線粒體。與模型組比較，高劑量FFCR可明顯減少模型小鼠大腦皮層8-OhdG表達，而安理申則對8-OhdG表達無顯著影響。

圖1 復(fù)方蓯蓉益智膠囊對D-半乳糖致癡呆小鼠腦組織8-羥基-2’-脫氧鳥苷表達的影響(×200)A正常對照組；B模型組；C陽性藥組；D復(fù)方蓯蓉益智膠囊高劑量組(標(biāo)尺長度為200 μm)

2.3 復(fù)方蓯蓉益智膠囊對D-半乳糖致癡呆小鼠腦組織SOD活性的影響

表2顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠腦組織SOD活性顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，F(xiàn)FCR各組可顯著提高模型小鼠腦內(nèi)SOD活性(P<0.05)，并呈劑量依賴關(guān)系。其中高劑量FFCR可使模型小鼠SOD水平提高59.87%，說明FFCR可有效清除超氧陰離子，保護腦組織免受氧化損傷。

表2 復(fù)方蓯蓉益智膠囊對D-半乳糖致癡呆小鼠腦組織SOD活性的影響

注：與正常對照組比較：ΔΔP<0.01；與模型組比較:*P<0.05

2.4 復(fù)方蓯蓉益智膠囊對D-半乳糖致癡呆小鼠腦組織GSH-PX活性的影響

表3顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠腦內(nèi)GSH-PX活性顯著降低(P<0.01)。與模型組比較，F(xiàn)FCR各劑量組以劑量依賴方式顯著提高GSH-PX活性(P<0.01或P<0.05)，其中高劑量FFCR可使模型小鼠GSH-PX水平提高78.81%，說明FFCR可顯著提高D-半乳糖致癡呆小鼠腦組織抗氧化能力，而陽性藥(安理申)對GSH-PX的影響不顯著。

2.5 復(fù)方蓯蓉益智膠囊對D-半乳糖致癡呆小鼠腦組織MDA水平的影響

表4顯示，與正常對照組比較，模型小鼠腦組織內(nèi)MDA水平顯著增高(P<0.01)，表明脂質(zhì)過氧化損傷參與了D-半乳糖對腦組織的損傷損傷過程。與模型組比較，F(xiàn)FCR各組均可顯著降低MDA水平(P<0.01或P<0.05)，其中高劑量FFCR可使模型小鼠腦內(nèi)MDA水平降低31.89%，表明FFCR可有效阻止D-半乳糖致癡呆小鼠腦內(nèi)的脂質(zhì)過氧化損傷，而陽性藥(安理申)對模型小鼠腦內(nèi)MDA水平影響不顯著。

表3 復(fù)方蓯蓉益智膠囊對D-半乳糖致癡呆小鼠腦組織GSH-PX活性的影響

注：與正常對照組比較：ΔΔP<0.01；與模型組比較:*P<0.05，**P<0.01

表4 復(fù)方蓯蓉益智膠囊對D-半乳糖致癡呆小鼠腦組織MDA水平的影響

注：與正常對照組比較：ΔΔP<0.01；與模型組比較:*P<0.05，**P<0.01

3 討論

機體衰老后往往出現(xiàn)腎精虧虛、髓海不足和腦髓失養(yǎng)。AD的基本病機是腎虛濁毒、損傷腦絡(luò)，其中腎虛是AD發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)，而痰濁則是推動AD發(fā)展的重要因素[4]。針對AD“腎虛痰濁阻竅”病機，臨床上采用益腎化濁解毒法治療該病。復(fù)方蓯蓉益智膠囊由制首烏、荷葉、肉蓯蓉、地龍、漏蘆組成。方中制首烏、肉蓯蓉共為君藥，滋腎陰，益精血；荷葉升陽利濕，地龍清熱通絡(luò)，兩者相配使清陽以升、濁陰得降；漏蘆清熱解毒，共奏補腎益髓、活血化濁、解毒通絡(luò)之功。

AD是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性病變，有多種因素參與其病理過程，衰老是AD公認(rèn)的危險致病因素?，F(xiàn)代大量研究表明，以氧化損傷為核心的病理改變在AD病程惡化過程中發(fā)揮了重要作用。許多研究表明，在AD患者出現(xiàn)神經(jīng)損傷的極早期，易感神經(jīng)元即出現(xiàn)氧化損傷[5]，說明氧化損傷是AD發(fā)病早期的重要病理因素。在AD發(fā)病過程中，由于體內(nèi)氧化還原平衡受到破壞，機體內(nèi)抗氧化酶類包括SOD、GSH-PX活性下降，導(dǎo)致氧自由基大量釋放，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，造成脂質(zhì)過氧化、線粒體損傷等，進而損傷神經(jīng)細(xì)胞，影響記憶功能[6]。

本實驗從氧化損傷的角度研究益腎化濁解毒方藥復(fù)方蓯蓉益智膠囊對D-半乳糖致癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和氧化損傷的影響，以此探究益腎化濁解毒與抗氧化之間的聯(lián)系。本實驗結(jié)果顯示，復(fù)方蓯蓉益智膠囊可以劑量依賴的方式顯著提高D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老致癡呆小鼠腦內(nèi)抗氧化酶類的活性，提高機體抗氧化能力，減少氧化損傷，提高記憶能力，提示益腎化濁解毒法可通過提高機體抗氧化能力，保護線粒體功能，發(fā)揮治療作用。

[1] Alzheimer’s Disease International[M]. World Alzheimer Report， 2012.

[2] Cervellati C, Romani A, Seripa D, et al. Oxidative balance, homocysteine, and uric acid levels in older patients with Late Onset Alzheimer’s Disease or Vascular Dementia[J]. J Neurol Sci， 2014,337(1-2):156-161.

[3] 王月芳，萬海同. 論腎虛痰凝血瘀是老年癡呆的重要發(fā)病機理[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1999,5(8):9-12.

[4] 張艷霞, 張允嶺. 基于現(xiàn)代文獻的老年性癡呆證型及證候要素分布研究[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2011,34(6):417-420.

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