逍遙散對大鼠阿爾茨海默病模型海馬CA1區(qū)相關指標的影響*

趙唯賢，李宜培，李高申，劉建濤，王保偉，郭梅珍

(1.河南醫(yī)學高等?？茖W校，鄭州 451141；2. 黃河科技學院, 鄭州 450006)

阿爾茨海默病(alzheimer’s diseas,AD)是一種以進行性認知障礙和記憶能力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其起病潛隱，病程呈進行性發(fā)展,甚至導致癡呆。隨著社會的發(fā)展，人們平均壽命的增加，AD作為當今最常見的癡呆類型，逐漸成為威脅人類健康的最重要疾病之一[1]。本研究通過觀察逍遙散干預后AD大鼠模型海馬相關指標的變化，旨在為未來AD的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

采用清潔級SD雄性大鼠，鼠齡在4～5個月，體質量(250±20)g，購自河南省實驗動物中心(批號SCXX(豫)2010-0002)。

1.2 藥物

逍遙散組成：柴胡、當歸、白芍、茯苓、炙甘草、生姜、薄荷，各藥間按10∶10∶10∶10∶5∶1∶1比例配比，由我院科研制劑室嚴格按中藥煎劑制備流程制作。于每日用藥前2 h開始即時配備，最后濃縮藥液濃度為2 g/mL，備用。奧拉西坦藥粉(奧拉西坦膠囊，石藥集團歐意藥業(yè)有限公司提供，400 mg/粒，批號05110703)，于每日用藥前30 min用常溫蒸餾水稀釋成濃度為150 mg/mL的奧拉西坦溶液，備用。

1.3 試劑

D-半乳糖(D-gal，Genview公司產(chǎn)品，北京鼎國昌盛生物技術有限公司分裝，批號22L10133)、A-β1～42peptide(北京博奧森生物技術有限公司提供，批號990901)、PP2A(蛋白磷酸酶-2A)-antibody(abgent，編號 AJ1644a)、GSK-3β(糖原合成酶激酶-3β)、antibody(CST，編號 9315s)、冷凍包埋劑 McCormick(USA)、TritonX-100 Amresco(USA)。

1.4 儀器

DMS2 型 Morris 水迷宮系統(tǒng)(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)、藍星 B 型腦立體定位儀2H-(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司產(chǎn))、潔凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、Image-pro Plus 5.0 圖像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 動物分組

將大鼠適應性喂養(yǎng) 3 d，光照節(jié)律12L∶12D(6∶00～18∶00)，室溫22～24℃，濕度30%～40%，喂食普通鼠用顆粒飼料(河南省實驗動物中心提供)，自由飲水。根據(jù)水迷宮實驗結果，留用成績最優(yōu)者作為正式實驗用大鼠，并按隨機數(shù)字表法分為生理組(A 組)、模型組(B 組)、西藥組(C 組)和中藥組(D組)。

2.2 模型制作

B、C、D 3組采用 D-gal 腹腔注射和 A-β1～42peptide 雙側海馬注射聯(lián)合造模[2～4]。方法：①自造模第1天始，每天上午9∶00～10∶00按1 mL/100 g劑量，大鼠左下腹腹腔注射D-gal(濃度：10 mg·mL-1)連續(xù)42 d；②D-gal造模結束，大鼠腹腔注射 10% 水合氯醛(0.4 mL/100 g)，麻醉后固定在腦立體定位儀，常規(guī)消毒，正中矢狀切開皮膚，確定左右側海馬位置，牙科鉆開顱暴露硬腦膜，將事前孵育好的A-β生理鹽水溶液(濃度：5μg·μL-1)，用微量注射器在10 min內每側海馬緩慢注入2 μL。A組用等體積滅菌生理鹽水如前進行海馬、腹腔注射造模。

2.3 干預方法

自全部造模結束后的第4天，每天上午9∶00對各組大鼠進行灌胃給藥干預，每日灌胃1次，連續(xù)干預治療28 d，灌胃體積均為0.5 mL/100 g。A、B組均采用生理鹽水灌胃， C、D組分別采用奧拉西坦溶液和逍遙散煎劑灌胃。

2.4 標本取材

干預治療完成后第4天，用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉，斷頭處死取出大腦組織，放在滴有4℃的4%戊二醛固定液的蠟板上(蠟板放在冰盒上)，迅速用刀片從正中剖開大腦，用注射器抽取4℃的4%戊二醛固定液沖洗大腦組織，沖洗固定1～2 min迅速分離海馬，切成1 mm×1 mm×1 mm小塊，分組標記并放入裝有4℃的4%戊二醛固定液磨口玻璃瓶中密封，4℃保存待檢。

2.5 石蠟切片制備

將大鼠海馬進行修塊、包埋和切片，控制各組中每個指標的切片平面相近。

2.6 免疫組織化學染色程序(ABC法)

將切片從4℃冰箱中取出室溫放置20 min，在0.5% TritonX-100溶液中37℃孵育10 min。10%的正常羊血清原液封閉(用0.5% TritonX-100 溶液稀釋)室溫輕搖1 h，吸掉封閉血清，加入用5%羊血清和0.5% TritonX-100 混合液稀釋的一抗(PP2A稀釋度為1∶200，GSK-3β稀釋度為1∶150)，室溫孵育3 h。加入生物素標記的二抗(用5%羊血清和0.5% TritonX-100 混合液稀釋，稀釋度為1∶500)，室溫孵育1 h；加入配好的ABC反應液(1∶100)，室溫孵育2 h。

2.7 圖像處理

選取每批每組冠狀切面相似的切片進行照像，圖像在Image-pro Plus 5.0 圖像分析系統(tǒng)中進行分析。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，4組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

3 結果

大鼠海馬CA1區(qū)PP2A和GSK-3β的陽性反應物呈棕黃色顆粒，主要表達于胞漿和細胞核。圖像及數(shù)據(jù)分析顯示，PP2A在海馬CA1區(qū)的表達，生理組中PP-2A陽性細胞數(shù)量較多，而模型組陽性細胞數(shù)量明顯減少，陽性物面積、MOD、IOD均有明顯下降(P<0.05)；經(jīng)藥物干預治療后，西藥及中藥組PP-2A陽性細胞數(shù)量、陽性物面積、MOD、IOD較模型組均有明顯增加(P<0.05)(見表1)。生理組中GSK-3β陽性細胞數(shù)量較少，而模型組中GSK-3β陽性細胞數(shù)量、陽性物面積、MOD、IOD均較生理組有明顯上升(P<0.05)；經(jīng)藥物干預后，中西藥組GSK-3β陽性細胞數(shù)量、陽性物面積、MOD、IOD均較模型組明顯下降(P<0.01)(見表2)。

4 討論

GSK-3β屬于蛋白激酶，與神經(jīng)退行性病變有密切聯(lián)系。在AD 的病理形成過程中，它使微管相關蛋白(Tau 蛋白)磷酸化，Tau 磷酸化后導致微管蛋白不穩(wěn)定，聚集成神經(jīng)纖維纏結，導致神經(jīng)元可塑性改變及神經(jīng)元退行性變化[5]。另外，GSK-3β可致使大鼠海馬神經(jīng)元內可溶性Aβ前體蛋白(SAPP) 沉積而形成老年斑，而PP-2A在信號傳導中承擔著負性調節(jié)作用。有研究認為，PP2A 活性降低可能是導致AD腦中Tau蛋白過度磷酸化的原因[4]。在AD模型大腦的病變區(qū)域PP-2A的表達和活性上調，能使GSK-3Ser9 去磷酸化，激活GSK-3[6]。在細胞的凋亡、增生、分化、代謝中起重要作用。

表1 PP2A在海馬CA1區(qū)表達的變化

注：與生理組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

表2 GSK-3β在海馬CA1區(qū)表達的變化

注：與生理組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.01

現(xiàn)在研究多認為，AD發(fā)病其基本病機為五臟虛衰, 特別強調腎虛精虧的作用[7，8]，似淡化了肝在AD發(fā)病中的作用。實際上，AD早期常表現(xiàn)為典型的抑郁癥狀和對日?；顒拥呐d趣喪失、記憶力減退、智力下降、意念消極、性格改變等,中醫(yī)臨床常將其歸屬于“呆病”、“郁證”等門類。當今社會中老年人獨身居住、孤獨寂寞，加重了情緒壓抑；離異喪偶或子女不孝，更導致精神創(chuàng)傷，這些社會問題均促成情志的失調而引起肝的疏泄失常。百病生于氣,氣行則血暢、水濕行、清竅聰、神明清、百病無由；肝血足則腎精充,髓海得養(yǎng),神魂安藏。因此，“肝氣郁結”在今日社會中對本病的發(fā)病具有重要意義。

逍遙散為疏肝解郁、健脾和營的重要方劑，其在精神科應用所涉及到的疾病(癥)種類就有13種，包括隱匿性抑郁癥、憂郁癥、癔癥、神經(jīng)官能癥等[9]。有研究顯示，逍遙散可提高小鼠學習記憶能力,降低潛伏時間,提高腦組織勻漿超氧化物歧化酶、膽堿乙酰轉移酶、單胺類氧化酶的活性,降低丙二醛含量和乙酰膽堿酯酶活性[10]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶C(PKC)在細胞凋亡中的作用日益突出，PKC活性過高或過低都會影響到細胞內信號的傳導,導致細胞的生長失?；虻蛲?。經(jīng)逍遙散治療后應激大鼠海馬突觸體PKC活性升高的幅度明顯小于病理對照組[6]。臨床方面，朱振鐸認為七情失調、情志抑郁不遂是AD的主要病因。而此因素致肝疏泄功能減退、肝郁氣滯，稍受刺激即抑郁難解，久而成呆。因而，以疏肝解郁組方觀察組對記憶力等綜合積分明顯提高[11]。

本研究提示，經(jīng)逍遙散干預后PP-2A在大鼠海馬CA1區(qū)的表達中，陽性細胞數(shù)量較模型組明顯增加，陽性物面積、MOD、IOD也均有明顯增加(P<0.05)。而GSK-3β經(jīng)逍遙散干預后，陽性細胞數(shù)量、陽性物面積、MOD、IOD下降均有明顯的統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

因此，以疏肝立法從一個方面提示了對AD模型某個環(huán)節(jié)的影響作用。隨著AD發(fā)病率的上升，對家庭和社會帶來的沉重負擔也日益凸顯，成為嚴重的社會問題，而加強相關面的研究已成為醫(yī)務人員乃至政府工作的重要任務。

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