Bmi-1基因在人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其意義

單 嶠，王新軍，王世勛，李培棟，吳建珩，李曉輝

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40%～50%，盡管近年來采用手術(shù)、放療、化療等方法治療有了很大的進(jìn)展，但惡性膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然很差。Bmi-1(B-cell specific Moloney murine leukemia virus integration site-1)基因是在鼠淋巴瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，是多梳基因(ploycomb group genes,PcG)家族的重要成員之一，目前認(rèn)為Bmi-1是一種原癌基因[1]。Bmi-1在調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新、細(xì)胞增殖、周期調(diào)控和抗凋亡等方面具有十分重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1在人類淋巴瘤、喉癌、肺癌、大腸癌、胰腺癌、宮頸癌等腫瘤中呈高表達(dá)，與這些腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后息息相關(guān)[2]。目前，國內(nèi)外對(duì)Bmi-1基因在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及作用的研究報(bào)道較少。本研究通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白印跡法(Western blotting)檢測Bmi-1在不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況，探討其在膠質(zhì)瘤發(fā)生、進(jìn)展中的作用機(jī)制以及與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月—2013年3月在鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院住院的膠質(zhì)瘤患者術(shù)后標(biāo)本82例，術(shù)前均未行放、化療。根據(jù)《2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤組織學(xué)分類》[3]標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)：低級(jí)別膠質(zhì)瘤組(Ⅰ～Ⅱ級(jí))37例，其中少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤13例、星形細(xì)胞瘤8例、室管膜瘤6例、室管膜下巨細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤5例、彌漫性星形細(xì)胞瘤3例、毛細(xì)胞黏液樣星形細(xì)胞瘤2例，男20例、女17例，年齡31～82歲，平均(58.6±6.7)歲；高級(jí)別膠質(zhì)瘤組(Ⅲ～Ⅳ級(jí))45例，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤14例、髓母細(xì)胞瘤9例、間變性星形細(xì)胞瘤8例、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤5例、室管膜母細(xì)胞瘤5例、間變性神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞瘤4例，男24例、女21例，年齡34～88歲，平均(61.3±7.8)歲。另收集腦創(chuàng)傷行內(nèi)減壓去除的腦組織32例作為對(duì)照組，男17例，女15例，年齡(60.5±7.1)歲。各組的性別、年齡間有均衡性。所有標(biāo)本取下后立刻放入液氮中，-196 ℃保存。

1.2 RT-PCR 采用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Bmi-1上游引物：5′-AATCTAAGGAGGAGGTGA-3′，下游引物：5′-CAAACAAGAGGTGGAAAG-3′，引物長度472 bp；β-actin上游引物：5′-AGAAAGGAAGGCTGGAGTGC-3′，下游引物：5′-AGACTGGGACATGGAAACGA-3′，引物長度186 bp。應(yīng)用RT-PCR試劑盒〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕，按照說明書完成實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，應(yīng)用美國Eagle EyeⅡ型凝膠圖像軟件測定目的基因的吸光度值。

1.3 Western blotting 裂解組織提取蛋白，應(yīng)用二辛可酸(bicinchoninic acid,BCA)法對(duì)蛋白進(jìn)行定量。分別于10%、7% SDS-PAGE電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氯乙烯膜(PVDF)膜上，50 mg/L脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗兔抗人Bmi-1單克隆抗體(1∶400，Santa公司)進(jìn)行孵育，4 ℃，過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1 000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行孵育，室溫，1 h。ECL發(fā)光試劑盒暗室發(fā)光、顯影、定影。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測Bmi-1 mRNA的表達(dá)水平 低級(jí)別和高級(jí)別膠質(zhì)瘤組Bmi-1 mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；高級(jí)別膠質(zhì)瘤組Bmi-1 mRNA表達(dá)水平較低級(jí)別膠質(zhì)瘤組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1、圖1)。

2.2 Western blotting 檢測Bmi-1 蛋白的表達(dá)水平 低級(jí)別和高級(jí)別膠質(zhì)瘤組Bmi-1蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高級(jí)別膠質(zhì)瘤組Bmi-1蛋白表達(dá)水平較低級(jí)別膠質(zhì)瘤組上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖2)。

Table1 Expression levels of Bmi-1 mRNA in glioma group and in control group

組別例數(shù)Bmi-1/β-actinmRNA對(duì)照組320.143±0.066低級(jí)別膠質(zhì)瘤組370.376±0.082*高級(jí)別膠質(zhì)瘤組450.708±0.119*△F值53.365P值0.000

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低級(jí)別膠質(zhì)瘤組比較，△P<0.05

Table2 Expression levels of Bmi-1 protein in glioma group and in control group

組別例數(shù)Bmi-1/β-actin蛋白對(duì)照組320.192±0.072低級(jí)別膠質(zhì)瘤組370.395±0.096*高級(jí)別膠質(zhì)瘤組450.769±0.124*△F值48.692P值0.000

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與低級(jí)別膠質(zhì)瘤組比較，△P<0.05

圖1 RT-PCR檢測Bmi-1 mRNA表達(dá)水平

圖2 Western blotting檢測Bmi-1蛋白表達(dá)水平

3 討論

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生是一個(gè)多基因、多步驟、多階段的復(fù)雜過程。近年來，人們已認(rèn)識(shí)到細(xì)胞周期調(diào)控紊亂與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)，進(jìn)而開始研究腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制。PcG家族是在進(jìn)化中高度保守的防止細(xì)胞表型發(fā)生改變而記憶轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的細(xì)胞記憶系統(tǒng)的重要組成部分。其參與對(duì)同源異型基因(Hox)表達(dá)的抑制，且與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞的增殖及腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[4]。Bmi-1是PcG家族的核心成員之一，定位于10p13，含有10個(gè)外顯子，能夠編碼326個(gè)氨基酸，相對(duì)分子量為45 kD。Bmi-1是一種廣泛表達(dá)的核蛋白，在DNA損傷修復(fù)、染色質(zhì)的穩(wěn)定、細(xì)胞周期的調(diào)控、基因轉(zhuǎn)錄激活及抗凋亡等方面起著重要作用。近年來研究表明，Bmi-1在人體多種惡性腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，提示Bmi-1在研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制及治療等方面可能具有較高的潛在價(jià)值[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)，無論在mRNA水平還是蛋白水平，膠質(zhì)瘤中Bmi-1的表達(dá)水平均高于對(duì)照組，提示Bmi-1可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生過程中起著重要作用，這與H?yry等[6]的研究結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，Bmi-1基因和蛋白在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組中的表達(dá)高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤組?？梢姡z質(zhì)瘤的惡性程度越高，Bmi-1表達(dá)就越高，提示Bmi-1可能在膠質(zhì)瘤的進(jìn)展過程中起重要的促進(jìn)作用，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。Gopinath等[7]應(yīng)用顯色原位雜交技術(shù)對(duì)100例Ⅱ～Ⅳ級(jí)人膠質(zhì)瘤進(jìn)行了Bmi-1基因位點(diǎn)復(fù)制數(shù)目的研究，發(fā)現(xiàn)均有Bmi-1基因位點(diǎn)復(fù)制數(shù)目的增加，其在高級(jí)別膠質(zhì)瘤組增加尤為明顯，說明Bmi-1可能促進(jìn)了膠質(zhì)瘤的發(fā)生。Bmi-1作為轉(zhuǎn)錄抑制因子可負(fù)性調(diào)控下游位點(diǎn)INK4a-ARF。INK4a-ARF位點(diǎn)能夠編碼細(xì)胞增殖抑制蛋白：p16INK4a和p14ARF，這兩種蛋白可以分別通過腫瘤抑制蛋白pRb和轉(zhuǎn)錄因子p53相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)途徑而發(fā)揮作用，從而影響細(xì)胞的增殖和凋亡。膠質(zhì)瘤中Bmi-1過表達(dá)時(shí)，p16INK4a表達(dá)下調(diào)，高磷酸化的pRb與轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合使細(xì)胞進(jìn)入S期，延緩膠質(zhì)瘤細(xì)胞的衰老和凋亡[8]。同樣，Bmi-1可負(fù)性調(diào)控p14ARF的表達(dá)，從而影響鋅指蛋白MDM2與p53的結(jié)合，控制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖過程?？梢姡珺mi-1極有可能在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中處于活化狀態(tài)，通過參與對(duì)p16、p15和p53等抑癌基因的異常沉默，使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CKD)持續(xù)性活化和細(xì)胞周期失控，從而使膠質(zhì)瘤細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。另外，Gargiulo等[9]發(fā)現(xiàn)Bmi-1與上皮細(xì)胞端粒酶的活性有關(guān)，其表達(dá)增高能夠上調(diào)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的轉(zhuǎn)錄，使端粒酶的活性增高，阻止膠質(zhì)瘤細(xì)胞衰老并導(dǎo)致永生化。此外，Bmi-1是神經(jīng)嵴干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵因素，神經(jīng)嵴干細(xì)胞自我更新的過程中Bmi-1的過表達(dá)可能使細(xì)胞的分化異常、凋亡被抑制，這可能是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤發(fā)生的另外一種機(jī)制。

膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)是患者預(yù)后的關(guān)鍵因素之一。本研究結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)越高，Bmi-1表達(dá)越高。Acquati等[10]研究也發(fā)現(xiàn)Bmi-1陽性的膠質(zhì)瘤患者的2年生存率顯著低于Bmi-1陰性的膠質(zhì)瘤患者。Bmi-1能夠使腫瘤細(xì)胞對(duì)一些化療藥物產(chǎn)生耐藥性，腫瘤細(xì)胞內(nèi)Bmi-1的表達(dá)越高，其對(duì)化療藥物的耐藥程度也越高，這對(duì)膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后不利。有研究表明，抑制Bmi-1的表達(dá)能夠明顯增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[11]。這些研究提示抑制Bmi-1能夠增強(qiáng)化療藥物的作用，為最大程、限度地根除腫瘤細(xì)胞提供了一個(gè)可能的治療途徑。最近一項(xiàng)研究報(bào)道，以Bmi-1 siRNA轉(zhuǎn)染U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞株后，通過RT-PCR法證實(shí)Bmi-1在U251細(xì)胞中表達(dá)降低，接下來應(yīng)用CCK8觀察到被干擾的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖速度比未干擾的細(xì)胞減慢[12]。這些研究提示通過抑制Bmi-1可能達(dá)到治療膠質(zhì)瘤的目的。因此，進(jìn)一步探索Bmi-1在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的分子學(xué)機(jī)制將有助于更好地闡述膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為，而下調(diào)Bmi-1的表達(dá)則可能成為治療膠質(zhì)瘤的新方法。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Bmi-1與膠質(zhì)瘤的形成及惡性程度存在一定的聯(lián)系，很可能參與膠質(zhì)瘤惡變的某些環(huán)節(jié)。Bmi-1過表達(dá)引起的INK4a-ARF下調(diào)可能是膠質(zhì)瘤發(fā)生的重要基礎(chǔ)，但其在膠質(zhì)瘤中的具體分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。Bmi-1表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)相關(guān)，提示Bmi-1有望成為預(yù)測膠質(zhì)瘤進(jìn)展和預(yù)后的新指標(biāo)。本研究豐富了人們對(duì)膠質(zhì)瘤治療的探索，下調(diào)Bmi-1的表達(dá)可能會(huì)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、增加膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡和提高化療藥物的敏感性，為膠質(zhì)瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)和理論基礎(chǔ)。

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