HPLC法測定不同產(chǎn)地赤芍中芍藥苷的含量及重金屬和殘留農(nóng)藥的分析

陳 述

（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科，北京，100091）

中藥研究

HPLC法測定不同產(chǎn)地赤芍中芍藥苷的含量及重金屬和殘留農(nóng)藥的分析

陳 述

（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科，北京，100091）

目的：建立一種測定赤芍中芍藥苷含量的高效液相色譜法，測定不同產(chǎn)地赤芍中芍藥苷的含量并分析赤芍中重金屬含量及農(nóng)藥的殘留量。方法：色譜柱：Kromasil C18柱（5μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（30∶70）；波長：230 nm；柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10μL。采用原子吸收分光光度法對赤芍藥材中的重金屬鉛、砷、銅、鎘、汞進行分析，同時采用氣相色譜法對有機氯類農(nóng)藥殘留量進行測定。結(jié)果：芍藥苷在0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，濃度與峰面積的線性關(guān)系良好（R2＝0.999 6），樣品的平均加樣回收率為98.8%，RSD為0.29%。17個不同產(chǎn)地的赤芍藥材中芍藥苷的含量為2.17%～4.17%；赤芍中檢出鉛、砷、銅、鎘、汞的殘留量分別為0.19～0.39、0.19～0.72、0.87～8.17、0.11～0.29和0.08～0.14mg/kg；部分赤芍藥材中有檢出有機氯類，DHC、DDT、PCNB的殘留量分別為0.021～0.063、0.039～0.121和0.024～0.050 mg/kg。結(jié)論：17個產(chǎn)地的赤芍藥材中芍藥苷的含量均符合中國藥典要求；藥材存在一定量的重金屬和有機氯類農(nóng)藥殘留，除1份藥材DDT含量超標外，其他藥材的重金屬及農(nóng)藥殘留量均符合《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》中的限量規(guī)定，赤芍藥材總體質(zhì)量較好。

不同產(chǎn)地；赤芍；高效液相色譜法；芍藥苷；重金屬殘留；農(nóng)藥殘留

赤芍是由毛茛科植物芍藥或者川赤芍的干燥根制成，是臨床應(yīng)用歷史悠久、用量較大的著名野生中藥材［1］，具有清血分實熱［2］，散瘀血留滯的功能，主要是用于治療瘀滯經(jīng)閉［3］，腹脅疼痛，疝瘕積聚［4］，目赤腫痛等病癥［5］。近年來，赤芍被廣泛應(yīng)用于治療心血管類疾病，且具備抗腫瘤［6］、保肝［7］、抗內(nèi)毒素、抑制胃酸分泌等藥理作用［8］。赤芍中含有單萜苷、鞣質(zhì)、三萜皂苷、兒茶素、芳香酸等多類化學(xué)成分［9］。目前研究多認為單萜苷類化合物（即赤芍總苷）是赤芍中的主要活性成分，赤芍總苷中主要包含芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等化合物［10］，其中以芍藥苷占赤芍總苷的75%以上［11］，是作為評價赤芍藥材的質(zhì)量優(yōu)劣的指標性組分，由于土壤、水源、氣候、種植施肥方式等環(huán)境因素的差異影響，不同產(chǎn)地赤芍藥材中芍藥苷的含量也因地域影響呈現(xiàn)差異，并且重金屬及農(nóng)藥殘留也呈現(xiàn)地域性的差異。

本文建立了一種測定赤芍藥材中芍藥苷含量的高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），測定17個不同產(chǎn)地赤芍藥材中芍藥苷的含量，并且根據(jù)藥典方法對赤芍藥材中重金屬含量及有機氯類農(nóng)藥殘留量進行測定分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試藥 高效液相色譜儀（Waters1525，配備四元泵及雙波長紫外檢測器）；電子天平AL204（梅特勒公司）；原子吸收光譜儀（1020MPT，長春吉大小天鵝公司）；氣相色譜儀（Agilent 7890A）；芍藥苷標準對照品及赤芍對照藥材（中國藥品生物制品檢定所），其他不同產(chǎn)地藥材為市售；重金屬鉛、砷、銅、鎘、汞標準溶液（國家標準物質(zhì)研究中心）；色譜純乙腈、色譜純甲醇（Fisher公司）；實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 赤芍中芍藥苷含量的測定

1.2.1.1 色譜條件 采用反相高效液相色譜法，Kromasil C18柱（5μm，4.6 mm×250 mm）；流動相采用甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（30∶70）；UV檢測器選擇波長230 nm；柱溫25℃；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL。理論塔板數(shù)以芍藥苷峰計，不低于3 000。

1.2.1.2 對照品溶液的制備 先將芍藥苷對照品置于含五氧化二磷減壓干燥器中干燥36 h，待干燥完成后，準確稱取100 mg芍藥苷于50 m L容量瓶中，適量甲醇溶解后，繼續(xù)用甲醇定容至刻度，即得濃度為2 mg/mL的對照品溶液。

1.2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取赤芍粗粉0.5 g置于具塞三角瓶中，加入甲醇35 m L，浸泡4 h后，超聲30 min，冷卻至室溫后，經(jīng)濾紙過濾于50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻線，搖勻后經(jīng)0.45μm濾膜過濾，按“1.2.1.1”項下色譜條件進樣，分析。

1.2.1.4 標準曲線及線性范圍 分別精密移取上述芍藥苷對照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL，置于10 mL已標定的容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，獲得濃度為0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL的系列標準溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，以濃度（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標作線性回歸，得回歸方程為Y＝1.458 9×107X+12 542（R2＝0.999 6）。結(jié)果表明，芍藥苷在0.1～1.0 mg/m L范圍內(nèi)，濃度與峰面積的線性關(guān)系良好。

1.2.1.5 精密度 取上述芍藥苷對照品溶液適量，配制成低、中、高（0.1、0.4、0.8 mg/mL）濃度的芍藥苷對照品溶液，各平行配制5份，按“1.2.1.1”項下色譜條件進樣分析，1 d內(nèi)連續(xù)進樣5次，連續(xù)測定3 d，測定其峰面積，計算峰面積的日內(nèi)及日間RSD，結(jié)果日內(nèi)RSD值為0.39%，日間RSD為1.02%。

1.2.1.6 重復(fù)性 準確稱取赤芍粗粉末0.5 g，平行稱取6份，按“1.2.1.3”項下方法制備供試品的溶液，并按“1.2.1.1”項下色譜條件進行分析，根據(jù)標準曲線計算芍藥苷的含量。結(jié)果表明，樣品中芍藥苷的平均含量為4.17%，RSD為0.21%，說明本方法的重復(fù)性良好。

1.2.1.7 穩(wěn)定性 取同一供試品溶液，在室溫下放置0，2，4，8，10 h后，按“1.2.1.1”項下色譜條件進行分析，測定的不同時間點芍藥苷的峰面積，并與0小時的峰面積相比較，結(jié)果不同時間點間的RSD值為0.89%，表明供試液在10 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

1.2.1.8 加樣回收率 準確稱取已知含量的赤芍藥材6份，平均分成3份，按照低、中、高3個水平分別準確加入一定量的標準品溶液，按“1.2.1.3”項下方法制備供試品溶液，并按“1.2.1.1”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積。

1.2.1.9 樣品含量測定 選取17個產(chǎn)地的赤芍藥材，粉碎后過3號篩，準確稱取0.5 g制備好樣品各三份。按“1.2.1.3”項下方法制備供試品溶液，制備完成后，按“1.2.1.1”項下色譜條件進行分析，記錄峰面積。

1.2.2 重金屬鉛、砷、銅、鎘、汞的測定 參照2010年《中華人民共和國藥典》，采用原子吸收分光光度法對來自17個不同產(chǎn)地的赤芍藥材中的重金屬鉛、砷、銅、鎘、汞進行了測定。按照《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》中對于重金屬元素的限量指標為：鉛（Pb）≤5 mg/kg、砷（As）≤2.0 mg/kg，銅（Cu）≤20 mg/kg、鎘（Cd）≤0.3 mg/kg、汞（Hg）≤0.2 mg/kg。

1.2.3 氣相色譜法測定有機氯農(nóng)藥殘留 參照《中華人民共和國藥典》2000版一部附錄IXQ有機氯農(nóng)藥殘留量測定法，對來自17個不同產(chǎn)地的赤芍藥材中有機氯類農(nóng)藥：六六六（BHC）、滴滴涕（DDT）、五氯硝基苯（PCNB）的殘留量進行測定，測定結(jié)果見表4。按照《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》的限量規(guī)定：六六六（BHC）≤0.1 mg/kg、滴滴涕（DDT）≤0.1 mg/kg、五氯硝基苯（PCNB）≤0.1 mg/kg。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)標準曲線計算樣品中芍藥苷的含量 測得低、中、高濃度樣品的平均回收率為98.8%，RSD為0.29%，具體結(jié)果見表1。

表1 HPLC-UV法測定赤芍中芍藥苷含量的回收率（n＝6）

2.2 根據(jù)標準曲線計算樣品中芍藥苷的含量 色譜圖如圖1所示，測定結(jié)果見表2。

圖1 標準對照品與樣品的高效液相色譜圖（芍藥苷）

表2 不同產(chǎn)地赤芍中芍藥苷含量測定結(jié)果

2.3 重金屬鉛、砷、銅、鎘、汞的測定 測定結(jié)果見表3。2.4 氣相色譜法測定有機氯農(nóng)藥殘留 具體結(jié)果見表4。

3 結(jié)論

筆者建立了測定不同產(chǎn)地赤芍藥材中芍藥苷含量的HPLC方法，該方法線性良好，線性范圍為0.1～1.0 mg/mL，平均加標回收率為98.8%，RSD為0.29%（n＝6），方法精密度及穩(wěn)定性良好，方法測定17個不同產(chǎn)地的赤芍藥材中芍藥苷的含量為2.17%～4.17%，各產(chǎn)地的赤芍藥材中含量有所差異，但均符合2010年《中華人民共和國藥典》中赤芍藥材中含芍藥苷不得少于1.8%的規(guī)定。其中，以內(nèi)蒙古扎蘭屯所產(chǎn)的赤芍藥材的中芍藥苷含量最高為4.17%，

部分產(chǎn)地的赤芍藥材檢出重金屬，赤芍中檢出的鉛、砷、銅、鎘、汞的殘留量分別為0.19～0.39 mg/kg、0.19～0.72 mg/kg、0.87～8.17 mg/kg、0.11～0.29 mg/kg、0.08～0.14 mg/kg；其中以銅元素檢出率最高，17個產(chǎn)地中全部有檢出，其他元素部分產(chǎn)地有檢出，呈現(xiàn)地域差異，藥材中重金屬含量均符合《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》中的限量要求［12］。

表3 不同產(chǎn)地赤芍中重金屬的測定結(jié)果

表4 不同產(chǎn)地中有機氯類農(nóng)藥的殘留量（mg/kg）

農(nóng)藥殘留是中藥藥材質(zhì)量的重要控制方面，多地的赤芍藥材檢出有機氯類，DHC、DDT、PCNB的殘留量分別為0.021～0.063 mg/kg、0.039～0.121 mg/kg、0.024～0.050 mg/kg，其中以DDT的檢出率較高，17地中僅有黑龍江寶清所產(chǎn)的赤芍中DDT含量達到0.121 mg/kg，超過《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》中對于DDT≤0.1 mg/kg的限量要求，原因可能是主要是由于有機氯農(nóng)藥半衰期長，早期的大量使用導(dǎo)致土壤及水體中殘留，導(dǎo)致該地區(qū)的中藥材出現(xiàn)農(nóng)藥殘留量超標現(xiàn)象［13］。

綜上所述，赤芍藥材的質(zhì)量因產(chǎn)地不同而呈現(xiàn)地域性差異，測定芍藥苷的含量及重金屬、農(nóng)藥殘留量，對于赤芍的內(nèi)在質(zhì)量的評價及其臨床用藥安全具有重要價值，本研究將為準確評價赤芍的質(zhì)量提供參考和依據(jù)。

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（2014-02-07收稿 責任編輯：曹柏）

Analysis of Paeoniflorin，Residual Pesticide and Heavy M etal Content Determ ination in Radix Paeoniae Rub ra from Different Habitats by HPLC

Chen Shu
（Pharmacy Department of Xiyuan Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100091，China）

Objective：To establish a HPLCmethod to determine the content of paeoniflorin aswell as residual pesticide and heavymetal in Radix Paeoniae Rubra in different areas.Methods：Chromatographic column was Kromasil C18column（5μm，4.6mm×250mm）；mobile phase wasmethanol-0.05mol/L potassium dihydrogen phosphate（30：70）；wavelength was230 nm；column temperaturewas25℃；flow rate was1mL/min；sample size was10 L.Analysisofheavymetal lead，arsenic，copper，cadmium，mercury in Paeonia lactiflora were determined by atomic absorption spectrophotometry，and gas chromatography was used for the determination of organochlorine pesticide residues.Results：The contentof paeoniflorin was in the range of0.1 to1.0mg/mL，and the linear relationship between concentration and peak area（R2＝0.9996）were good.The average recovery was 98.8%，and RSD was 0.29%.The content of paeoniflorin in Radix Paeoniae Rubra from 17 differentareaswas2.17～4.17%；residues of arsenic，lead，copper，cadmium，mercury in Radix Paeoniae Rubra were 0.19～0.39，0.19～0.72，0.87～8.17，0.11～0.29 and 0.08～0.14mg/kg；part of Paeonia lactiflora found the detection of organochlorine residues，and DHC，DDT，PCNB were respectively 0.021～0.063，0.039～0.121 and 0.024～0.050mg/kg.Conclusion：The contents of paeoniflorin in Paeonia lactiflora in 17 areas were all in accord with the Chinese pharmacopoeial requirements；there is a certain amount ofmetalmaterials and organic chlorine pesticide residues inmedicinalmaterials，and except1 copy of DDT content exceeding the standard，the quantity are in line with the“medicinal plants and preparations of the green trade standard”in the provisions on limits of heavymetal and pesticide residue in othermedicinal herbs.The overall quality of Paeonia lactiflora is good.

Origin；Radix Paeoniae Rubra；HPLC；Paeoniflorin；Heavymetals；Pesticide residues

R284.1

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.09.034