欣月片的急性經(jīng)口毒性和遺傳毒性實驗研究

錢星文 雷曉林 彭 菊 李俊葵 劉 偉*

欣月片的急性經(jīng)口毒性和遺傳毒性實驗研究

錢星文1雷曉林1彭 菊2李俊葵2劉 偉1*

（1廣東省東方藥林藥業(yè)有限公司，廣州510520；2南方醫(yī)科大學(xué)，廣州510520）

目的評價欣月片的安全性，為其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。方法按照GB15193～2003《食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法》進行大小鼠的急性經(jīng)口毒性實驗，Ames實驗，小鼠骨髓細胞微核試驗及小鼠睪丸染色體畸變試驗。結(jié)果欣月片的急性經(jīng)口LD50＞20.0g／kg BW；三項遺傳毒性實驗結(jié)果均為陰性。結(jié)論欣月片對小鼠的急性經(jīng)口毒性屬無毒；未見遺傳毒性作用。

欣月片；急性經(jīng)口毒性；遺傳毒性

東方藥林牌欣月片是由東方藥林藥業(yè)有限公司專門為女性研發(fā)的一款保健食品。其主要成分為淫羊藿、骨碎補、阿膠、大豆異黃酮等，經(jīng)動物實驗證明，其具有增加骨密度的保健功能。欣月片的開發(fā)前景看好，但是，目前欣月片的安全性未知，我們根據(jù)GB15193～2003《食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法》對欣月片的提取物進行急性經(jīng)口毒性和遺傳毒性實驗?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 東方藥林牌欣月片（女士），每日的服用劑量為6.84g／60kg·BW·日，送檢樣品為去除輔料樣品，棕色粉末2.5kg，去輔料樣品相當于成品樣品5.79kg（原料輔料比例約為1∶1.32），去輔料樣品每日服用劑量為2.95g／60kg·BW·日，由東方藥林藥業(yè)有限公司提供。

1.1.2實驗動物SPF級昆明種小鼠和Wistar大鼠，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號為SCXK-（京）2006-0009 0151282，0151285，0154756，0155142（分別用于急性經(jīng)口毒性試驗、骨髓細胞微核試驗和睪丸染色體試驗）。

1.1.3實驗動物環(huán)境SPF級實驗動物室合格證號：SYXK（津）2008-0004。溫度：20～25℃，濕度：40～70%RH。飼料由天津市華榮實驗動物科技有限公司提供，飼料生產(chǎn)許可證號：SCXK（津）2006-0001。

1.2方法［1］

1.2.1經(jīng)口急性毒性試驗

1.2.1.1小鼠經(jīng)口急性毒性試驗（最大耐受量法）選用18～22g SPF級昆明種小鼠20只，雌雄各半，禁食16小時后進行實驗，以20.0g／kg·BW的劑量，間隔6小時灌胃兩次，每次灌胃體積為0.20m1／10g·BW，給藥后連續(xù)觀察14天。記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.2.1.2大鼠經(jīng)口急性毒性試驗（最大耐受量法）選用180～220g SPF級Wistar大鼠20只，雌雄各半，禁食16小時后進行試驗，以20.0g／kg·BW的劑量，間隔6小時灌胃兩次，每次灌胃體積為2.0m1／100g·BW，給藥后連續(xù)觀察14天。記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。

1.2.2遺傳毒性試驗

1.2.2.1Ames試驗采用經(jīng)鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型TA97、TA 98、TA 100、TA 102四株試驗菌株進行試驗。用多氯聯(lián)苯（PCB）誘導(dǎo)大鼠后制備的肝勻漿（S-9）作為體外代謝活化系統(tǒng)。稱取0.5g樣品，加無菌蒸餾水至10ml，混勻高壓滅菌，混勻后為①液；?、僖?ml，加無菌蒸餾水8ml，混勻后為②液；?、谝?ml，加無菌蒸餾水8ml，混勻后為③液；?、垡?ml，加無菌蒸餾水8ml，混勻后為④液；?、芤?ml，加無菌蒸餾水8ml，混勻后為⑤液（受試物濃度分別為50、10、2、0.4、0.08mg／ml）。試驗設(shè)8、40、200、1000、5000ug／皿5個劑量，同時設(shè)空白對照及陽性對照。在頂層瓊脂中加入0.1ml試驗菌株增菌液、0.1ml受試物和0.5ml S-9混合液（當需要代謝活化時），混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，每個劑量及對照均做3個平行樣。在37℃培養(yǎng)48h，計數(shù)每皿回變菌落數(shù)。受試物的回變菌落數(shù)是空白對照菌落數(shù)2倍以上，并具有劑量—反應(yīng)關(guān)系者則定為陽。整套試驗在相同條件下重復(fù)進行一次。

1.2.2.2小鼠骨髓細胞微核試驗采用間隔24h兩次經(jīng)口灌胃法進行試驗。用體重25～30g小鼠50只，隨機分為5組，每組10只，雌雄各半。以40mg／kg.BW劑量的環(huán)磷酰胺為陽性對照（稱取環(huán)磷酰胺40.0mg，加無菌生理鹽水至10ml，經(jīng)腹腔注射給藥，給藥量為0.1ml／10g. BW）。樣品劑量分別為2.5、5.0、10.0g／kg.BW，分別稱取樣品2.50g、5.00g、10.00g，加蒸餾水至20ml，充分混勻，濃度分別為0.125、0.250、0.500g／ml，灌胃體積為0.2ml／10g.BW，對照組給等量蒸餾水。末次給樣品后6h，頸椎脫臼處死動物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，甲醇固定，Giemsa染色。在光學(xué)顯微鏡下，每只動物計數(shù)1000個嗜多染紅細胞（PCE），微核發(fā)生率以含微核的PCE千分率計，并進行統(tǒng)計處理，統(tǒng)計方法用泊松分布，另外計算嗜多染紅細胞與成熟紅細胞的比例（PCE／NCE）。

1.2.2.3小鼠睪丸染色體畸變試驗用體重25～30克的性成熟雄性小鼠25只，隨機分為5組，每組5只。以2.0mg／kg·BW劑量的絲裂霉素為陽性對照（稱取絲裂霉素4.0mg，加無菌生理鹽水至20ml，腹腔注射，給藥量為0.1ml／10g·BW），每天一次，連續(xù)兩天。樣品劑量分別為2.5、5.0、10.0g／kg·BW，分別稱取樣品5.00g、10.00g、20.00g，加蒸餾水至40ml，充分混勻，濃度分別為0.125、0.250、0.500g／ml，灌胃量為0.2ml／10g·BW，每日灌胃一次，連續(xù)5天，對照組給等量蒸餾水。于首次給予受試物后的第十三天，5組同時腹腔注射秋水仙素一次（6mg／kg.BW），6h后處死動物，取雙側(cè)睪丸制片，Giemsa染色，每組分析5只動物的染色體，每只動物分析100個中期相細胞，計算睪丸染色體畸變發(fā)生率（以百分率計），用SPSS 11.5 for Windows中檢驗進行統(tǒng)計處理。

2 結(jié)果

2.1急性毒性試驗由表1、2可見，大小鼠分別以20.0g／kg·BW的劑量灌胃，兩種性別的大、小鼠，觀察14天，實驗期間未見明顯的中毒表現(xiàn)，動物無死亡，尸檢中各主要臟器亦未見異常。受試物對兩種性別的大、小鼠的經(jīng)口急性毒性（MTD）均大于20.0g／kg.BW，根據(jù)急性毒性分級標準，東方藥林牌欣月片（女士）屬無毒級。

表1 東方藥林牌欣月片（女士）對小鼠的急性毒性

表2 東方藥林牌欣月片（女士）對大鼠的急性毒性

2.2遺傳毒性試驗

2.2.1Ames試驗由表3、4可見，樣品各劑量組回變菌落數(shù)均未超過空白對照菌落數(shù)的2倍，亦無劑量—反應(yīng)關(guān)系。對鼠傷寒沙門氏菌TA 97、TA98、TA 100、TA102四株試驗菌株，各劑量組在加與不加S9時，回變菌落數(shù)均未超過空白對照菌落數(shù)的2倍，亦無劑量-反應(yīng)關(guān)系，試驗結(jié)果為陰性。

表3 東方藥林輝欣月片（女士）Ames試驗結(jié)果（第一次實驗）（x±s）

表4 東方藥林牌欣月片（女士）Ames試驗結(jié)果（重復(fù)實驗）（x±s）

2.2.2小鼠骨髓細胞微核試驗由表5可見，樣品各劑量組微核率與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而環(huán)磷酰胺組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），表明東方藥林牌欣月片（女士）對小鼠骨髓細胞微核試驗結(jié)果為陰性。

表5 東方藥林牌欣月片（女士）對小鼠骨髓微核發(fā)生率的影響

2.2.3小鼠睪丸染色體畸變試驗可見，樣品各劑量組小鼠睪丸染色體畸變發(fā)生率與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而絲裂霉素陽性對照組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。因此，未見東方藥林牌欣月片（女士）對小鼠睪丸染色體畸變產(chǎn)生影響。

表6 東方藥林牌欣月片（女士）對小鼠睪丸染色體畸變發(fā)生率的影響

3討論

東方藥林牌欣月片（女士），其主要成分淫羊藿、骨碎補、阿膠、大豆異黃酮等，有研究表明，骨碎補總黃酮具有較強的抗膝骨關(guān)節(jié)炎的作用［2］，對老年性成骨疏松也有治療作用［3］。淫羊藿具有補腎陽，強筋骨等作用，大豆異黃酮又稱植物雌激素，能夠彌補30歲以后女性雌性激素分泌不足的缺陷，改善皮膚水分及彈性狀況，緩解更年期綜合癥和改善骨質(zhì)疏松。因而，東方藥林牌欣月片（女士）能夠很好地達到增加女性骨密度的作用。本實驗研究結(jié)果表明，東方藥林牌欣月片（女士）對兩種性別的大、小鼠經(jīng)口急性毒性LD50均大于20.0g／kg·BW，三項遺傳毒性結(jié)果均為陰性，說明東方藥林牌欣月片（女士）是一種服用安全，保健功能確切的保健食品。

［1］GB15193-2003.食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法［J］.2003：17-55.

［2］龔曉健，李運曼，安佰平，等.骨碎補總黃酮的抗膝骨關(guān)節(jié)炎作用［J］.中國天然藥物，2006，4（3）：215-218.

［3］眭承志.骨碎樸總黃酮對老年性骨質(zhì)琉松癥成骨作用影響的臨床與實驗研究［D］.福州：福建中醫(yī)學(xué)院，2008.

St u d y on a c u t e t o xicit y t h r o u gh mo u t h an d g en e tic t o xicit y o f Xin yue table t

Qian Xingw en1Lei Xiaolin1Peng Ju2Li Junkui2Liu Wei11
（1 Oriental Pharmaceutical Co.，Ltd.Guangzhou，510515，China；2 Southern Medical University，Guangzhou，510515，China）

ObjectiveTo evaluate the toxicological safety of Xinyue tablet in order to provide some scientific data for its application.Methodsccording to GB15193-2003‘Food safety toxicology evaluation procedures and methods'，the following experiments of acute toxicity test through mouth in mice，experiments of ames，experiments of micronuclei of bone marrow cell and testicle chromosome aberration in mice.ResultsLD50was more than 20.0g／kg BW for Xinyue tablet，three genetic toxicity test results were negative.ConclusionsXinyue tablet for acute oral toxicity in mice is nontoxic；no genetic toxicity.

Xinyue tablet；Acute toxicity test；Genetic toxicity

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.04.093

：1672-2779（2014）-04-0148-03

蘇 玲 本文校對：劉 儀

2013-11-08）

*通訊作者