均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選干蟾中吲哚類生物堿的水提工藝※

李 偉 王元清 嚴(yán)建業(yè) 羅 堃*

均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選干蟾中吲哚類生物堿的水提工藝※

李 偉1王元清2，3嚴(yán)建業(yè)2羅 堃2*

（1湖南省湘潭市中心醫(yī)院，湘潭411100；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥現(xiàn)代化教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙410208；3中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生物技術(shù)與工程實(shí)驗(yàn)室，長沙410004）

目的優(yōu)選干蟾中吲哚類生物堿的最佳提取工藝。方法以吲哚類生物堿浸出量、浸膏得率為評價(jià)指標(biāo)，對提取次數(shù)進(jìn)行考察；選擇浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、溶媒用量等為影響因素，應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選其最佳提取工藝。結(jié)果最佳工藝條件為：水提3次，浸泡15min，加水量為14倍、12倍、12倍，提取時(shí)間為100min、80min、80min。結(jié)論該工藝穩(wěn)定，可行，能為其工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

干蟾；均勻設(shè)計(jì)；提取工藝；吲哚類生物堿

干蟾收載于衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)，為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍B.melanostictus Schneider的去除內(nèi)臟的干燥全體［1-2］，其提取物具有強(qiáng)心、抗腫瘤、抗病毒、止痛、促進(jìn)骨髓增生等功效［3-4］。干蟾中有效活性成分主要分為水溶性成分和脂溶性成分，前者主要為吲哚類生物堿，后者主要有酯蟾毒配基等［5］。其中吲哚類生物堿具有較強(qiáng)的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗乙肝病毒等多種藥理作用。干蟾中吲哚類生物堿的含量較低，有關(guān)其提取工藝研究尚未見報(bào)道，本文首次采用均勻設(shè)計(jì)法結(jié)合多指標(biāo)綜合評價(jià)來優(yōu)選其水提工藝，為其進(jìn)一步的制劑開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1儀器SP-756型紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；DGF-4AB型立式電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Shimadzu AY-120型電子分析天平（日本島津公司）。

1.2材料5-羥色胺（批號：1130661-31205079，供含量測定用，由Sigma公司提供）；干蟾（批號：20101206，湖南省醫(yī)藥銷售有限公司提供），經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉塔斯教授鑒定；對二甲氨基苯甲醛、鹽酸等均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1吲哚類生物堿的含量測定［6］

2.1.1對照品溶液的制備精密稱取5-羥色胺對照品0.0062g，置于10mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容至刻度。精密移取0.5m L置于10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（濃度為31μg／mL）。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立精密量取5-羥色胺對照品溶液0.5、1.5、2.5、3.5、5.0mL，分別置于10mL量瓶中，各加水至5mL，搖勻。加15%對二甲氨基苯甲醛鹽酸溶液（2→3）至刻度，搖勻，放置30min，照分光光度法，以水做空白對照（5mL水加5mL15%對二甲氨基苯甲醛鹽酸溶液，搖勻），在555nm的波長處測定吸光值。以5-羥色胺濃度（C）對吸光度（A）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A =0.0031C+0.0855（r=0.9996），提示5-羥色胺濃度在1.55～15.5μg／mL范圍內(nèi)與吸收度線性關(guān)系良好。

2.1.3樣品溶液中吲哚類生物堿的含量測定精密量取各樣品溶液2mL，置于10mL量瓶中，依法顯色，測定吸光度，并計(jì)算含量。

2.2浸膏得率的測定精密吸取樣品液25mL，置于105℃已干燥至恒重（W1）的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃真空干燥3h，置干燥器中冷卻30min，迅速稱重（W2），按下列公式計(jì)算，即得。

浸膏得率%=［（W2-W1）×V提取液總）／（M干蟾×25）］×100%。其中：V提取液總表示提取液的總體積（mL），M干蟾表示每次投的干蟾的重量（mg）。

2.3提取工藝研究

2.3.1提取次數(shù)的考察稱取干蟾10g，加水浸泡0.5小時(shí)，加熱回流提取三次，加水量分別為10倍、8倍、8倍，提取時(shí)間分別為1.5h、1.0h、1.0h。分別收集各次提取液，定容，備用。取提取液，按前述方法分別測定吲哚類生物堿含量。結(jié)果表明，前兩次提取量占三次提取總量的73%，提示兩次提取不完全，因而需提取3次為宜。

2.3.2藥材粒徑的考察稱取干蟾10g，共三份，分別為最粗粉、粗粉、中粉，加水浸泡0.5小時(shí)，加熱回流提取三次，加水量分別為10倍、8倍、8倍，提取時(shí)間分別為1.5h、1.0h、1.0h。收集提取液，定容，備用。取提取液，按前述方法分別測定吲哚類生物堿含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最粗粉、粗粉、中粉的含量分別為1.128、1.322、1.319mg／g?？梢?，干蟾粉碎成粗粉時(shí)，吲哚類生物堿的浸出量較高，因而選擇粉碎成粗粉為宜。

2.3.3浸泡時(shí)間的考察稱取干蟾10g，粉碎成粗粉，共四份，各加水浸泡時(shí)間為0min、30min、60min、90min，加水倍量均為10倍、8倍、8倍，提取時(shí)間為1.5h、1.0h、1.0h，分別提取，收集提取液，按前述方法分別測定吲哚類生物堿含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加水浸泡0min、30min、60min、90 min時(shí)吲哚類生物堿含量分別為1.036、1.318、1.315、1.321mg／g?？梢?，干蟾藥材浸泡30 min左右時(shí)，總生物堿的浸出量較高，因而選擇浸泡30min為宜。

2.3.4U5*（53）均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)［7］優(yōu)選提取工藝依據(jù)單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，并考慮中藥提取工藝的主要影響因素，選擇提取時(shí)間、浸泡時(shí)間、加水倍量為考察因素，以吲哚類生物堿含量和浸膏得率為評價(jià)指標(biāo)，用U5*（53）均勻設(shè)計(jì)表安排試驗(yàn)（見表1），依法進(jìn)行測定、計(jì)算（見表2）。

表1 U5*（53）均勻設(shè)計(jì)因素水平表

表2 U5*（53）均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用spss15.0統(tǒng)計(jì)軟件對上述均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用后退回歸法進(jìn)行回歸分析。加權(quán)值Y與因素X1、X2、X3關(guān)系的分析：以Y對X1、X2、X3及其交叉項(xiàng)進(jìn)行后退回歸，得回歸方程：Y=63.346+0.197 X1X3。其復(fù)相關(guān)系數(shù)P=0.924；調(diào)整決定系數(shù)Ra=0.854；F= 17.495，P=0.025＜0.05。表明該方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。方程中只保留了X1X3項(xiàng)，表明X1與X3存在一定的交互作用。X1X3的系數(shù)為正值，顯示與加權(quán)值呈正相關(guān)。

最佳提取條件的確定：根據(jù)上述相關(guān)性的分析，因素X1X3項(xiàng)的系數(shù)為正值，X1與X3均大于或等于0，當(dāng)它們增大時(shí)，Y也增大。因此因素X1可定為最大值4.75h，X3可定為最大值38倍，代入方程，得方程Y=63.346+ 0.197 X1X3，計(jì)算出y的理論預(yù)測值為98.90。X2對Y沒有影響，為節(jié)約時(shí)間，提高效率，又使干蟾較充分潤濕，可將浸泡時(shí)間定為15min。因此，干蟾中吲哚類生物堿的最佳水提工藝為：加水浸泡15min，加水量分別為14倍、12倍、12倍，提取時(shí)間分別為100min、80min、80min。

2.3.5驗(yàn)證試驗(yàn)取3批干蟾藥材，每批100g，均按最佳水提工藝提取3次，分別測定吲哚類生物堿浸出量和浸膏得率（見表3）。結(jié)果表明，該工藝穩(wěn)定、可行。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3討論

有關(guān)蟾蜍的藥用藥材有干蟾、蟾皮、蟾酥、蟾衣等，其中干蟾和蟾皮在市場流通過程中有混用現(xiàn)象，其化學(xué)成分和臨床應(yīng)用研究報(bào)道較多，而有關(guān)其吲哚類生物堿的提取工藝研究較少。本試驗(yàn)優(yōu)選出了干蟾中吲哚類生物堿的最佳提取工藝條件，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明該工藝穩(wěn)定、可行，可為其進(jìn)一步的制劑開發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

本試驗(yàn)中比色法測定的基本原理：吲哚類生物堿分子中的芳伯胺可與芳醛（如對二甲氨基苯甲醛）發(fā)生縮合反應(yīng)，在酸性溶液中生成有色的希夫氏堿，此有色物質(zhì)在某個(gè)波長處有明顯的吸收峰。試驗(yàn)結(jié)果表明，此法專屬性強(qiáng)，方法靈敏，重現(xiàn)性好，操作簡便。在試驗(yàn)過程中，發(fā)現(xiàn)樣品的最佳含量測定條件為：溫度控制在20℃以上，加入顯色劑后，樣品在20～30min內(nèi)測定，吸收值穩(wěn)定。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥材第一冊［S］.1992：4.

［2］衛(wèi)生部藥政管理局，中國藥品生物制品檢定所.中藥材手冊［M］.1990：629.

［3］張紹杰，劉誠進(jìn).淺談蟾蜍的藥用價(jià)值［J］.中華臨床醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，13（10）：1397-1398.

［4］逯華，陳日新.華蟾素抗惡性腫瘤的研究進(jìn)展［J］.右江民族醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，1（5）：895-896.

［5］董巖，羅濛，姜同英，等.華蟾素注射乳劑的制備及制劑質(zhì)量的研究［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（1）：6-9.

［6］王元清，嚴(yán)建業(yè)，喻林華，等.華蟾素分散片溶出度的研究［J］.中成藥，2008，30（11）：1667-1669.

［7］王元清，嚴(yán)建業(yè)，陳志文，等.均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選玉米須中總黃酮和多糖的水提工藝［J］.食品與機(jī)械，2010，136（2）：104-106.

Optimizing the water extracting conditions of Indole Alkaloids from Siccus Bufo by uniform design

LiWei1Wang Yuanqing2，3Yan Jianye2Luo Kun2?
（1 Xiangtan Central Hospital，Hunan Xiangtan provicine，411100，China；2 Key Lab of Modernization of Chinese Medicine，collega of Pharmacy，Hunan University of Chinese M edicine，Changsha 410208，China；3 Lab of Biotechnology and Engineering，College of Life Science and Technology，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China）

ObjectiveTo study the optimum extracting process for indole alkaloids from Siccus Bufo.MethodsThe extraction rate of extractum and extraction amount of indole alkaloids of Siccus Bufo were choosen as the assessment index，with solvent volume，macerating time and extracting time as examming factor，the optimum extraction progress was selected with the uniform design.ResultsThe optimum extraction progress conditions were as follows：macerated for 15 min in water，decocting for 3 times，with water of 14，12，12 times of the drug mixture respectively，105 min，80min，80min respectively.ConclusionThe extraction process of optimization can extract more indole alkaloids，and can provide the test foundation for production.

Siccus Bufo；uniform design；extraction process；indole alkaloids

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.04.091

：1672-2779（2014）-04-0144-03

蘇 玲 本文校對：林麗美

2013-11-06）

湖南中醫(yī)藥大學(xué)青年基金項(xiàng)目［No：99820001］；湖南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目［No：湘教通（2010）212號］

*通訊作者