金匱腎氣丸化裁方對(duì)良性前列腺增生大鼠前列腺組織VEGF、IGF-1表達(dá)的影響※

張喜奎 盧志銓 吳 棟

實(shí)驗(yàn)研究

金匱腎氣丸化裁方對(duì)良性前列腺增生大鼠前列腺組織VEGF、IGF-1表達(dá)的影響※

張喜奎1盧志銓2吳 棟2

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福州350004；2福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州350108）

目的研究金匱腎氣丸化裁方對(duì)大鼠前列腺增生模型前列腺組織VEGF和IGF-1表達(dá)的影響。方法去勢(shì)加丙酸睪酮注射法建立大鼠前列腺增生模型，免疫組化學(xué)法檢測(cè)前列腺組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)類胰島素生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）mRNA的水平。結(jié)果金匱腎氣丸化裁方中劑量組明顯降低前列腺增生組織中VEGF和IGF-1 mRNA的水平。結(jié)論金匱腎氣丸化裁抑制大鼠前列腺增生可能與調(diào)控生長(zhǎng)因子表達(dá)水平有關(guān)。

金匱腎氣丸；良性前列腺增生；VEGF；IGF-1

良性前列腺增生癥（Benign prostatic hyperlasia，BPH）是老年男性的常見病、多發(fā)病之一。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)BPH的治療主要采用藥物和手術(shù)等方法治療，但藥物治療效果并非很理想，手術(shù)、激光、尿道內(nèi)支架等方法也都存在一定的并發(fā)癥［1］。有學(xué)者運(yùn)用腎氣丸［2-4］加減治療BPH，取得了一定的療效，筆者在臨床中選用金匱腎氣丸化裁方治療BPH亦取得了滿意的療效。本實(shí)驗(yàn)選用金匱腎氣丸化裁方對(duì)大鼠BPH模型進(jìn)行干預(yù)，分別采用免疫組織化學(xué)法及RT-PCR法檢測(cè)前列腺組織中VEGF、IGF-1的表達(dá)水平，進(jìn)而探討金匱腎氣丸化裁方治療BPH的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，雄性，體重180～220g，共60只，從上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)進(jìn)［許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002］，在福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［許可證號(hào)：SYXK（閩）2009-0001］進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2主要藥物與試劑①非那雄胺片：由杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)，5mg／片（產(chǎn)品批號(hào)：322787）；②金匱腎氣丸化裁方：干地黃24g，山萸肉12g，山藥12g，澤瀉9g，牡丹皮9g，茯苓6g，附子3g，桂枝3g，益母草10g，川牛膝10g，荔枝核12g。劑量參考新世紀(jì)《方劑學(xué)》、《中藥學(xué)》本科教材及臨床用藥經(jīng)驗(yàn)，中藥飲片由福建中醫(yī)學(xué)院國(guó)醫(yī)堂提供。全方水煎提取濃縮至2g／mL，4℃保存?zhèn)溆?；③丙酸睪酮注射液：由上海通用藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，25mg／ml（產(chǎn)品批號(hào)：120102）；④VEGF免疫組化檢測(cè)試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司提供；⑤二步法免疫組化試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司提供。⑥RT-PCR試劑盒：CWBIO公司提供。⑦溶媒：橄欖油，市售。

1.3主要儀器①離心機(jī)KDC-2046；②洗板機(jī)ELX-50；③石蠟切片機(jī)LEICA 2135；④光學(xué)顯微鏡OLYMPUS BX40；⑤醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)CMIAS-2001B；⑥組織勻漿器Bio Masher。⑦ABI 7500型熒光定量PCR儀。

1.4模型建立與分組取60只Wistar大鼠，雄性，體重180～220g，普通飼養(yǎng)觀察1周，隨機(jī)取10只為空白對(duì)照組（Ⅰ組），另外50只進(jìn)行造模。造模方法按文獻(xiàn)［5］并稍加改進(jìn)。先用10%水合氯醛0.3m1／100g腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒皮膚，經(jīng)陰囊摘除雙側(cè)睪丸，術(shù)后肌內(nèi)注射青霉素20萬(wàn)U／只。去勢(shì)第7天隨機(jī)分為病理模型組（Ⅱ組）、非那雄胺片（Ⅲ組）及中藥低劑量組（Ⅳ組）、中藥中劑量組（Ⅴ組）、中藥高劑量組（Ⅵ組），每組10只。每日皮下注射丙酸睪丸酮5mg／（kg·d），誘導(dǎo)前列腺增生，空白對(duì)照組每日皮下注射等量生理鹽水，連續(xù)28d。

1.5給藥干預(yù)手術(shù)大鼠恢復(fù)7d后，開始為期28d的治療。Ⅳ組、Ⅴ組、Ⅵ組分別給予中藥低劑量、中藥中劑量、中藥高劑量灌胃，大鼠給藥量按照人與大鼠體表面積法換算，低、中、高3個(gè)劑量組擬為臨床等效量的0.5、1、2倍量。根據(jù)實(shí)際情況，原濃度2g／mL給藥相當(dāng)于實(shí)際給藥量10g／kg。用蒸餾水作等比稀釋后按照5m1／kg灌胃給藥，每日1次。Ⅲ組給予非那雄胺片1mg／（kg·d）灌胃，Ⅰ組、Ⅱ組分別予等量生理鹽水灌胃。每7d稱重1次，根據(jù)體重調(diào)節(jié)給藥劑量。

1.6標(biāo)本采集給藥4周后，用頸椎脫臼法處死大鼠，取出前列腺組織，一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，用于VEGF檢測(cè)，一部分迅速放入-80℃冰箱冷藏，用于IGF-1檢測(cè)。

1.7觀測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法①一般情況：每日觀察大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、被毛、二便、飲食等情況；治療前后每周稱體重一次；②免疫組織化學(xué)法檢測(cè)前列腺組織中VEGF的表達(dá)：按ABC法常規(guī)步驟操作，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。棕黃色染色為VEGF陽(yáng)性表達(dá)。選取細(xì)胞分布均勻的高倍視野作為觀察區(qū)，將鏡下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)同總細(xì)胞數(shù)相比較，得到陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)率。每張切片觀察5個(gè)視野，取其平均值。③RT-PCR方法檢測(cè)前列腺組織中IGF-1 mRNA的表達(dá)：超純RNA提取試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat＃CW0581）提取RNA，DNaseⅠ試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat＃CW2090）對(duì)RNA中殘留的基因組DNA進(jìn)行消化處理。HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒（CWbio.Co.Ltd，Cat＃CW0744）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。選取各樣本cDNA分別用UltraSYBR Mixture（With ROX）（CWbio.Co.Ltd，Cat＃CW0956）進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增，采用熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)定量，并形成擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線圖，三孔重復(fù)CT值，取平均CT值，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法與評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值士標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用方差分析，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1一般情況觀察空白對(duì)照組大鼠反應(yīng)敏捷，神志、飲食、二便正常，皮毛致密而白凈。病理模型組大鼠飲食減少，消瘦，皮毛蓬松，脊背毛色呈黃褐色，枯槁無光澤。中藥低劑量組大鼠情況與病理模型組比較差別不大，其余各治療組大鼠一般情況好于病理模型組。

2.2各組大鼠前列腺組織中VEGF的表達(dá)比較病理模型組與空白對(duì)照組相比，VEGF呈現(xiàn)出強(qiáng)陽(yáng)性的表達(dá)反應(yīng)，即模型大鼠前列腺增生發(fā)生、發(fā)展過程中，在前列腺組織中存在VEGF的過度表達(dá)；非那雄胺組、金匱腎氣丸化裁方低、高劑量組與病理模型組比較雖有所減輕但遠(yuǎn)未達(dá)到正常，說明非那雄胺組、金匱腎氣丸化裁方低、高劑量組能抑制VEGF表達(dá)，但效果不佳；而金匱腎氣丸化裁方中劑量組能明顯抑制VEGF的表達(dá)，且趨近于空白對(duì)照組的表現(xiàn)，見表1。

表1 各組大鼠前列腺組織中VEGF的表達(dá)比較 （x±s，n=10）

2.3各組大鼠前列腺組織中IGF-1 mRNA的表達(dá)比較與空白組相比，病理模型組IGF-1 mRNA表達(dá)升高最為顯著；與模型組相比，中藥低劑量組IGF-1 mRNA表達(dá)降低無差異（P＞0.05），非那雄胺組、高劑量組IGF-1 mRNA表達(dá)降低有差異（P＜0.05），中劑量組存在顯著差異（P＜0.01）；與非那雄胺組相比，中藥中劑量組IGF-1 mRNA表達(dá)降低存在顯著差異（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠前列腺組織中IGF-1 mRNA的表達(dá)比較 （x±s）

3 討論

現(xiàn)代生理學(xué)研究表明，前列腺組織中含有各種生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子與前列腺細(xì)胞的增殖與凋亡均有直接關(guān)系。正常情況下，生長(zhǎng)促進(jìn)因子與生長(zhǎng)抑制因子的作用保持相對(duì)平衡，前列腺才能正常地發(fā)育、生長(zhǎng)，并維持其結(jié)構(gòu)與功能的完整［6］。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖過程中一個(gè)主要的正性調(diào)節(jié)因子［7］，有研究表明VEGF主要促進(jìn)血管內(nèi)皮增生并增加血管通透性，在BPH中呈高表達(dá)［8］。IGF-1是一種前列腺上皮細(xì)胞的有絲分裂原，對(duì)正常和轉(zhuǎn)化的前列腺上皮細(xì)胞具有抗細(xì)胞凋亡和促有絲分裂的作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，IGF-1水平的高低與前列腺增生的程度呈正相關(guān)［9］。

良性前列腺增生多屬中醫(yī)“癃閉”“精癃”病癥的范疇。中醫(yī)認(rèn)為，BPH基本病機(jī)是腎氣虧虛，瘀血痰濁聚結(jié)，病性多為本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜。治療上應(yīng)標(biāo)本兼顧，既重視腎氣虧虛之本，又兼顧瘀血阻滯之標(biāo)，充其腎氣，化其瘀滯。金匱腎氣丸化裁方由《金匱要略》腎氣丸方加味而成，全方由干地黃、山萸肉、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓、附子、桂枝、益母草、川牛膝、荔枝核組成。諸藥相合，共奏補(bǔ)益腎氣，活血化瘀，緩消癓瘕之效。全方非常切合BPH的基本病機(jī)。

本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，模型組大鼠前列腺組織VEGF陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，中藥劑量組VEGF陽(yáng)性表達(dá)率則明顯低于模型組，而趨近于對(duì)照組，說明金匱腎氣丸化裁方可以抑制VEGF的表達(dá)。RT-PCR熒光定量顯示，IGF-1在模型組大鼠前列腺組織中表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和中藥中劑量組，而對(duì)照組與中藥中劑量組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明金匱腎氣丸化裁方可以有效抑制BPH大鼠前列腺組織中IGF-1的表達(dá)。因此，通過調(diào)控生長(zhǎng)因子表達(dá)水平，可能是金匱腎氣丸化裁方抑制前列腺增生的作用機(jī)理。

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Effects of Modified Jinkui Shenqi pill on the Expression of Benign Prostatic Hyperplasia Rats prostate's VEGF，IGF-1

Zhang Xikui1Lu Zhiquan2W u Dong2
（The Second A ffiliated Hospital，F(xiàn)ujian uniuersity of traditional Chinesemedicine，F(xiàn)uzhou，350004，China）

ObjectiveTo study the therapeutic efficacy of Modified Jinkui Shenqi piu on the expression of VEGF，IGF-1 in prostate of benign prostate hyperplasia（BPH）rat model.MethodsRats were removal both of didymus and injected testosterone propionate to make model of benign prostatic hyperplasia rat.Use the method of immunohistochemistry to detect the expression of vascular endothelial growth factor VEGF，detect the level of insulin-like growth factor-one（IGF-1）mRNA in hyperplasia prostate tissue by RT-PCR.ResultsModified Jinkui Shenqi pill middle dose group could significantly reduce the levels of VEGF and IGF-1 mRNA in hyperplasia prostate tissue.ConclusionModified Jinkui Shenqi pill restrain benign prostatic hyperplasia may be related with regulate the expression of growth factors.

Jinkui Shenqi pill；Benign prostatic hyperplasia；VEGF；IGF-1

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.04.090

：1672-2779（2014）-04-0142-03

蘇 玲 本文校對(duì)：盧志銓

2013-11-08）

福建省自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目［3201-803110024］