心之絡(luò)病“孫絡(luò)疏失”模型大鼠心肌組織病理變化研究*

張俊修 霍 旺 王 朋 李紹旦 劉 毅 楊明會

（中國人民解放軍總醫(yī)院，北京 100853）

人體經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)由經(jīng)脈和絡(luò)脈組成，其中絡(luò)脈包括“十五絡(luò)脈”和難以計(jì)數(shù)的浮絡(luò)、孫絡(luò)等［1］。絡(luò)脈功能正常對維持心臟正常生理功能有重要作用。本研究從孫絡(luò)著手探尋絡(luò)脈病變對心臟的影響，通過建立大鼠“孫絡(luò)疏失”模型，多方面探討心之絡(luò)病“孫絡(luò)疏失”模型下心肌組織病理變化特征，為孫絡(luò)病變對心臟的影響提供病理學(xué)支持，進(jìn)而從整體論述孫絡(luò)病變在 “心之絡(luò)病”中的重要意義?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（220±20）g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，動物許可證號：SCXK-（軍）2012-0004。按每籠5只飼養(yǎng)于獨(dú)立通氣籠具系統(tǒng)內(nèi)，溫度（22±1）℃，濕度（50±5）%，每日光照與黑夜時(shí)間各12 h。實(shí)驗(yàn)期間造模、取材等操作均在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，添加飼料、換水等由專人負(fù)責(zé)管理。

1.2 主要試劑 烏拉坦 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號T2011110）；注射用青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號F3047216）；4%多聚甲醛（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號AR-0211）；50%戊二醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20111215）。

1.3 主要儀器 電子秤 （長沙湘平科技發(fā)展有限公司，EPS-2001）；小動物心電圖機(jī)（北京福田電子醫(yī)療儀器有限公司，F(xiàn)X-211）；動物呼吸機(jī)（上海奧爾科特生物科技有限公司，ALC-V9）；超凈工作臺（北京長城空氣凈化工程公司）；光學(xué)顯微鏡（CH-2，日本Olympus公司）；多功能顯微鏡帶相機(jī)（FDX-35，日本Nikon公司）；透射電子顯微鏡（H-7650，日本日立公司）；超薄切片機(jī)（UCT，德國萊卡公司）。

1.4 造模及分組 選取心電圖正常大鼠30只，按隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組、造模30min組、造模1 h組、造模6 h組、造模12 h組和造模24 h組。“孫絡(luò)疏失”大鼠模型造模參照文獻(xiàn)［2］，大鼠以20%烏拉坦按5mL/kg腹腔注射麻醉后，經(jīng)口氣管插管連接呼吸機(jī)，設(shè)定呼吸頻率 80 次/min、潮氣量 15mL/kg、呼吸比 1∶1。于大鼠左側(cè)胸壁3～4肋間橫向開胸，暴露心臟，撕開心包膜，在冠狀動脈左側(cè)主干處，左心耳下方約2～3mm處以左心耳與肺動脈圓錐間左冠狀靜脈主干為標(biāo)志結(jié)扎（假手術(shù)組只穿線，不接扎），進(jìn)針深度約1～1.5mm，寬約2.0mm，逐層關(guān)閉胸腔，待大鼠自主呼吸恢復(fù)后，移除呼吸機(jī)。以室壁運(yùn)動減弱，結(jié)扎下部心肌組織顏色變白，心電圖可見胸前各個導(dǎo)聯(lián)的sT段抬高、T波高聳為造模成功標(biāo)志。造模后每只大鼠一次性注射青霉素鈉40萬U預(yù)防感染。

1.5 標(biāo)本采集與處理 （1）HE染色。各組大鼠于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)以20%烏拉坦按5mL/kg腹腔注射麻醉后，經(jīng)頸動脈插管，以4%多聚甲醛心臟灌注，灌注結(jié)束后摘取心臟，10%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制備石蠟切片，超薄切片機(jī)切片，切片厚度5μm。行常規(guī)HE染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蘇木素液染色，1%鹽酸乙醇分化，返藍(lán)，乙醇伊紅染色，脫水，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)并拍照。（2）電鏡。各組大鼠于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)以20%烏拉坦按5mL/kg腹腔注射麻醉后，迅速摘取心臟，冰浴下于左心室游離壁（梗死區(qū)）及右心室（非梗死區(qū)）各取一塊組織［3］，每塊體積1mm×1mm×2mm，將組織塊固定于2.5%戊二醛中2 h，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗后，1%鋨酸后固定1 h，經(jīng)丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，片厚約70 nm，先后經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色，透射電鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色觀察結(jié)果 假手術(shù)組心肌纖維排列規(guī)則，橫紋清晰，心肌細(xì)胞核居中，未見組織壞死、血管擴(kuò)張及炎性細(xì)胞浸潤，無纖維疤痕組織增生。造模30min組心肌組織內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤及心肌細(xì)胞壞死溶解樣改變；造模1 h組，心肌組織內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤及心肌細(xì)胞壞死溶解樣改變。造模6 h組心肌組織內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞壞死溶解增多，心肌邊緣形態(tài)破壞。造模12 h組心肌組織內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞斑片狀壞死溶解，心肌邊緣形態(tài)破壞，開始出現(xiàn)纖維組織增生樣改變。造模24 h，心肌組織內(nèi)可見心肌細(xì)胞壞死溶解，心肌邊緣形態(tài)破壞，繼續(xù)出現(xiàn)細(xì)胞增生樣改變，炎性細(xì)胞浸潤此時(shí)已不明顯。各模型組非梗死區(qū)表現(xiàn)正常。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌HE染色切片形態(tài)學(xué)改變（光鏡，20倍）

2.2 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果 （1）假手術(shù)組：心肌細(xì)胞肌膜完整，核多呈不規(guī)則形，位于細(xì)胞中央，染色質(zhì)分布均勻，核膜完整，核周間隙正常（圖2A），肌原纖維排列整齊，肌節(jié)、Z線和M線清楚，閏盤結(jié)構(gòu)完整清晰，線粒體和糖原顆粒豐富，線粒體結(jié)構(gòu)大多正常，偶見輕度腫脹。間質(zhì)血管結(jié)構(gòu)正常，未見明顯淤血，內(nèi)皮細(xì)胞可見一定數(shù)量吞飲小泡，細(xì)胞間連接清晰，亦未見炎性細(xì)胞浸潤（圖3A）。（2）造模30min組：梗死區(qū)心肌細(xì)胞肌膜尚完整，但呈輕度指狀突起，細(xì)胞核形態(tài)和染色質(zhì)基本正常，核膜完整，核周間隙輕度增寬 （圖2B），肌原纖維排列基本整齊，然Z線和M線可見迂曲模糊，閏盤局灶性模糊，線粒體輕度腫脹，部分線粒體嵴排列紊亂，糖原顆粒輕度減少。間質(zhì)血管結(jié)構(gòu)正常，部分內(nèi)皮細(xì)胞間連接模糊（圖3B），間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤，非梗死區(qū)僅見線粒體輕度腫脹。（3）造模1 h組：梗死區(qū)心肌細(xì)胞肌膜尚完整，可見肌膜下水腫或指狀突起，心肌細(xì)胞水腫，核內(nèi)染色質(zhì)稀疏，核膜模糊，核周間隙增寬 （圖2C），肌原纖維排列紊亂或間隙增寬，Z線和M線模糊，可見肌原纖維輕度灶性溶解，閏盤局灶性模糊，線粒體輕至中度腫脹，線粒體嵴斷裂或排列紊亂，糖原顆粒明顯減少。間質(zhì)血管結(jié)構(gòu)正常，然內(nèi)皮細(xì)胞膜、胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間連接模糊（圖3C），間質(zhì)未見炎性細(xì)胞浸潤。非梗死區(qū)未出現(xiàn)細(xì)胞退變及內(nèi)皮細(xì)胞損傷改變，線粒體腫脹和肌膜下水腫較多見。（4）造模6 h組：梗死區(qū)心肌細(xì)胞肌膜指狀突起及髓鞘樣結(jié)構(gòu)形成，甚至出現(xiàn)肌膜破裂，心肌細(xì)胞核膜局灶性模糊，假包含體形成，甚至出現(xiàn)核膜破裂，細(xì)胞壞死（圖2D），肌原纖維排列紊亂，Z線和M線模糊且排列紊亂，可見肌原纖維灶性溶解，閏盤局灶性模糊，線粒體輕至中度腫脹，線粒體嵴斷裂或排列紊亂，髓鞘樣結(jié)構(gòu)形成，糖原顆粒明顯減少，脂滴增多。間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，細(xì)胞間連接模糊，基底膜斷裂，并可見單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤（圖3D）。非梗死區(qū)僅見線粒體及肌纖維病理性改變。（5）造模12 h組：梗死區(qū)心肌細(xì)胞肌膜指狀突起及肌膜下明顯水腫，甚至出現(xiàn)肌膜破裂；心肌細(xì)胞核膜模糊，假包含體增多，核周間隙增寬，核膜破裂、核碎裂甚至溶解（圖2E），肌原纖維斷裂溶解增多，Z線和閏盤模糊、斷裂，線粒體明顯腫脹，線粒體嵴斷裂或排列紊亂甚至空化，糖原顆粒明顯減少。間質(zhì)血管血管內(nèi)皮細(xì)胞壞死、凋亡，細(xì)胞間連接模糊，吞飲小泡增多（圖3E），并可見單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞侵潤，非梗死區(qū)未見壞死及凋亡改變。（6）造模24 h組：梗死區(qū)心肌細(xì)胞肌膜指狀突起及肌膜下水腫持續(xù)存在，但有所減輕，心肌細(xì)胞核膜局灶性模糊，核周間隙增寬，核染色質(zhì)凝集邊移呈凋亡或細(xì)胞壞死或細(xì)胞退變持續(xù)存在（圖2F），肌原纖維排列紊亂或呈波浪狀排列，Z線和M線模糊且排列紊亂，肌原纖維灶性溶解減少，閏盤局灶性模糊，糖原顆粒明顯減少仍存在，線粒體輕至中度腫脹，部分線粒體密度增高。間質(zhì)血管血管內(nèi)皮細(xì)胞仍可見壞死、凋亡，細(xì)胞間連接模糊，吞飲小泡增多（圖3F）。非梗死區(qū)未見壞死及凋亡改變。

圖2 各模型組大鼠心肌梗死區(qū)心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化（電鏡，4000 倍）

3 討 論

3.1 “孫絡(luò)疏失”模型 “孫絡(luò)疏失”是基于“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”理論提出的新概念。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，孫絡(luò)是人體絡(luò)脈的最小單位，對應(yīng)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的小血管、微血管，孫絡(luò)與微循環(huán)在結(jié)構(gòu)分布、生理功能、病理變化等方面具有同一性［4］?！皩O絡(luò)疏失”的病變基礎(chǔ)在微循環(huán)，“疏”指數(shù)量的減少，“失”是“疏”的進(jìn)一步加重，造成了小范圍內(nèi)的孫絡(luò)消失，同時(shí)“疏失”也指功能的缺失。大鼠冠狀動脈前降支結(jié)扎制作的心肌缺血模型，已被證實(shí)其微血管密度降低［5］，正與“孫絡(luò)疏失”相對應(yīng)，而孫絡(luò)滲灌氣血、濡養(yǎng)臟腑的功能受損，會導(dǎo)致“心主血脈”一系列正常生理功能受損，與心肌梗死后心功能各項(xiàng)指標(biāo)的異常表現(xiàn)相一致［6］。因此選擇結(jié)扎大鼠冠狀動脈前降支的方法來制作心之絡(luò)病“孫絡(luò)疏失”的大鼠模型。

3.2 “孫絡(luò)疏失”模型大鼠心肌組織病理變化 HE染色顯示，各模型組均存在不同程度的病理改變，30min及1 h以炎性細(xì)胞浸潤和部分心肌細(xì)胞壞死為主要改變，6 h炎性細(xì)胞浸潤最明顯并伴有心肌細(xì)胞壞死溶解改變，12 h和24 h以心肌組織內(nèi)增生改變?yōu)橹?，?4 h炎性細(xì)胞浸潤不明顯，病理變化逐漸由炎性細(xì)胞浸潤的輕度改變向心肌細(xì)胞壞死改變發(fā)展，在24 h內(nèi)可以連續(xù)觀察到此種變化，說明在“孫絡(luò)疏失”急性期，由于孫絡(luò)在數(shù)量和功能上的減少和降低，導(dǎo)致“心失所養(yǎng)”，產(chǎn)生了心肌組織一系列病理變化，提示孫絡(luò)是維持正常心肌組織結(jié)構(gòu)不可缺少的重要因素。

心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變是反映細(xì)胞損傷最直觀的指標(biāo)。線粒體是維持細(xì)胞能量的功能單位，與細(xì)胞功能有密切關(guān)系。心肌線粒體較多，緊貼肌原纖維。當(dāng)心肌缺血時(shí)，心肌線粒體出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)上的變化，直接影響對心肌能量的供應(yīng)［7］。本研究顯示，各模型組線粒體不同程度的腫脹，線粒體嵴斷裂或排列紊亂，髓鞘樣結(jié)構(gòu)形成，糖原顆粒明顯減少，表明線粒體功能障礙，而Z線和M線迂曲模糊，閏盤模糊，肌原纖維灶性溶解，心肌細(xì)胞水腫及心肌細(xì)胞壞死的出現(xiàn)，都說明在“孫絡(luò)疏失”急性期心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能都受到了極大的破壞。在心肌組織中，存在著大量微血管起到維持血液正常流態(tài)、調(diào)節(jié)微血管張力以及血管內(nèi)外營養(yǎng)物質(zhì)交換等作用，微血管結(jié)構(gòu)的完整性是生理功能得以發(fā)揮的重要基礎(chǔ)［8］。本研究結(jié)果顯示，微血管內(nèi)皮細(xì)胞病變涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞膜、胞內(nèi)細(xì)胞器結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間連接模糊、血管間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等病理變化，微血管結(jié)構(gòu)的破壞導(dǎo)致其功能的喪失，進(jìn)一步加重了心肌細(xì)胞功能的喪失，最終造成心肌梗死區(qū)的形成及其功能的減弱，而“孫絡(luò)疏失”是產(chǎn)生這些病理改變的根本原因。

綜上所述，在“孫絡(luò)疏失”急性期，孫絡(luò)的缺失，導(dǎo)致心肌組織產(chǎn)生了廣泛的病理變化。依據(jù)“脈絡(luò)-血管系統(tǒng)病”理論［9］，孫絡(luò)作為人體經(jīng)脈系統(tǒng)最末端結(jié)構(gòu)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)小血管、微血管特別是微循環(huán)具有同一性，二者在結(jié)構(gòu)分布、生理功能、病理變化等方面均具有密切相關(guān)性［4］，說明孫絡(luò)是心肌組織的一部分，“孫絡(luò)疏失”作為直接因素影響心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能，同時(shí)由于其功能的喪失，作為間接因素同樣影響著心肌組織的結(jié)構(gòu)和功能。所以，孫絡(luò)對維持心肌正常結(jié)構(gòu)功能起著不可替代的作用，而從孫絡(luò)著手治療心系疾病，值得進(jìn)一步研究。

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