CYFRA21-1雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法的研制①

張慧茹 翟晉豫 王雪琴 劉 珍 王云龍 米 海 (河南工業(yè)大學生物工程學院，鄭州450001)

CYFRA21-1雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法的研制①

張慧茹 翟晉豫②王雪琴 劉 珍 王云龍②米 海 (河南工業(yè)大學生物工程學院，鄭州450001)

目的:建立人血清CYFRA21-1雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法。方法:以高碘酸鈉法標記4株自制的CYFRA21-1單克隆抗體，從中篩選配對抗體，建立雙抗體夾心ELISA檢測方法，并對其特異性、穩(wěn)定性和靈敏度進行評價。結果:在4株單克隆抗體中篩選出1對配對抗體:2F9株做包被抗體、6F11株做酶標抗體。以0.50 μg/ml的包被濃度、1∶6 000的酶標抗體稀釋度建立雙抗體夾心檢測方法。標準曲線在0.7～25 ng/ml范圍內(nèi)成線性關系，相關性為99.08%，最低檢測限為0.666 8 ng/ml，回收率為98.14%;與血清類似物的交叉性反應低于0.1%;批內(nèi)(n=10)、批間(n=5)精密度分別為6.8%和11.4%，與國外試劑盒檢測對比的相關性為91.42%。結論:成功地建立了雙抗體夾心ELISA檢測人血清CYFRA21-1的方法，為后續(xù)的檢測試劑盒的生產(chǎn)奠定基礎。

CYFRA21-1;雙抗體夾心ELISA;肺癌;檢測試劑盒

目前，上皮癌的發(fā)病率越來越高，致死率也不斷提高，這引起了人們越來越多的關注，肺癌、食管鱗癌、宮頸癌、鼻咽癌等已成為各大醫(yī)療機構及科研院所研究的重點。出于對此類癌癥的早期檢測和預防，許多腫瘤標志物被發(fā)現(xiàn)并應用，主要包括有細胞角蛋白19片段(Cytokeratin 19 fragment 21-1，CYFRA21-1)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase，NSE)、癌胚抗原(Carcino-embryonic antigen， CEA)等[1-3]。神經(jīng)元特異性烯醇化酶是一類屬于與神經(jīng)性內(nèi)分泌組織起源相關的腫瘤標志物，對于上皮癌的診斷意義不大。癌胚抗原是一類具有廣譜性的輔助癌癥診斷標志物[4]?；诖耍瑢τ谏掀ぐ┑脑\斷以細胞角蛋白19片段的應用較為廣泛。

國內(nèi)外已有大量研究報道指出，CYFRA21-1可作為口腔鱗狀細胞癌、宮頸鱗癌、肺癌、胰腺癌等上皮細胞腫瘤性疾病的標志物[3，5]，通過檢測 CYFRA21-1在人血清中含量的變化，從而分析癌癥患者上皮細胞癌的生長狀況和患者的愈后。因此，各類CYFRA21-1診斷檢測手段便應運而生。目前常用的試劑盒多為德國Roche、法國CIS等國外產(chǎn)品，與國外產(chǎn)品相比，國內(nèi)研發(fā)的檢測試劑盒存在靈敏度低的問題，因此，本實驗目的在于研發(fā)CYFRA21-1雙抗體夾心ELISA檢測法，以提高國產(chǎn)檢測試劑盒的靈敏性。

1 材料與方法

1.1 材料 4株CYFRA21-1的mAb由河南工業(yè)大學與河南省生物工程中心聯(lián)合制備(腹水抗體為IgG1型抗體、效價高于 106)。辣根過氧化物酶(HRP)購于Sigma公司。HRP-羊抗鼠IgG購于美國Jackson公司。CYFRA21-1標準蛋白購于美國Cal Bioreagents公司。CK8、CK18購于Sigma公司。絨毛促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)購于上?？婆d生物有限公司。53名病患血清取自河南腫瘤醫(yī)院。CYFRA21-1 ELISA檢測試劑盒為德國Roche公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 HRP-mcAb的制備 利用改良過碘酸鈉法[6]將辣根過氧化物酶與4株抗 CYFRA21-1的mcAb進行偶聯(lián)，得到的酶-抗體(HRP-IgG)于－20℃保存。

1.2.2 配對抗體的篩選 取一定值陽性血清篩選最佳配對酶標抗體。以實驗室經(jīng)驗濃度100 ng/孔包被4種酶標抗體4℃過夜，PBST洗滌1遍，加入封閉液 150 μl/孔，37℃封閉 2 h，PBST 洗滌5 遍，加入定值血清，溫育30 min后洗滌;再加入1∶3 000倍稀釋的4種酶標抗體，37℃溫育30 min，洗滌;加底物顯色20 min后，終止液終止，雙波長讀取光密度值，分析最佳配對結果。

1.2.3 雙抗體夾心ELISA方法的建立 以棋盤滴定法確定包被抗體和酶標抗體的最佳工作濃度。將包被抗體稀釋為 3.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/ml，加到96孔板中，0.1 ml/孔，4℃過夜，洗滌1 次，拍干。加入封閉液37℃封閉2 h，洗滌、拍干，加入定值陽性血清，37℃反應30 min后洗滌、拍干;加入不同稀釋倍數(shù)的酶標抗體，0.1 ml/孔，37℃溫育 30 min，洗滌;底物顯色20 min后，終止液終止，酶標儀450 nm (參考波長630 nm)處檢測光密度值(OD)，確定最佳雙抗體夾心ELISA檢測方法。

1.2.4 標準曲線的繪制 采用建立的雙抗體夾心ELISA 方法，將 CYFRA21-1分別稀釋到100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0 ng/ml，每個濃度做 3個重復，測定OD450/630值，并以抗原濃度的自然對數(shù)值為橫坐標，OD值為縱坐標繪制標準曲線。

在標準曲線范圍內(nèi)選取高、中、低3個抗原濃度(n=5)，測定其OD值，依標準曲線查找對應的抗原濃度，與實際抗原濃度計算回收率。

1.2.5 特異性檢測 以建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法，分別檢測CK8、CK18、人絨毛促性腺激素(HCG)、人促卵泡激素(FSH)是否與CYFRA21-1之間存在交叉反應，檢驗檢測方法的特異性。

1.2.6 精密性測定 在標準曲線范圍內(nèi)選取高、中、低3個抗原濃度，在同一塊板上測定10次，另在不同包被板上檢測5次，每板測定5孔，對比其OD值變化，分別計算批內(nèi)精密性和批間精密性(變異系數(shù)CV)。

1.2.7 試劑盒對比檢測 利用醫(yī)院獲取的53份陽性血清樣本，通過本實驗構建的ELISA檢測方法與購買的檢測試劑盒同時進行檢測。并依照檢測結果比較二者的相關性。

2 結果

2.1 配對抗體的篩選 在實驗室常規(guī)ELISA檢測的基礎上，通過正交試驗篩選配對的酶標抗體，結果見表1。

依據(jù)表1的結果可以看出:以2F9株酶標單抗做包被抗體、6F11株酶標單抗做酶標抗體獲得最佳的ELISA檢測結果，說明2株單抗識別的抗原決定簇位點距離較遠。

2.2 雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立 以2F9株酶標單抗做包被抗體、6F11株酶標單抗做酶標抗體，通過棋盤法建立雙抗體夾心ELISA檢測方法。

從表2中的數(shù)據(jù)可以看出當包被抗體濃度為0.50 μg/ml(50 ng/孔)、酶標單抗稀釋濃度為1∶6 000時ELISA檢測效果較好，此時空白值為0.032，血清值為 2.044。

表1 篩選配對酶標抗體的結果Tab.1 Results of antibody pairing test

表2 單抗包被濃度及酶標單抗稀釋濃度的確定Tab.2 Determination coating concentration of mAb and dilution of mAb-HRP

圖1 CYFRA21-1標準曲線Fig.1 Standard curve of CYFRA21-1

2.3 繪制標準曲線 將CYFRA21-1稀釋不同濃度，采用雙抗體夾心ELISA法測定OD456/630值，繪制標準曲線。

由圖1可知，抗原在0.7～25 ng/ml范圍內(nèi)成線性關系，取該范圍的抗原濃度與OD值確定二者的回歸方程:y=1.569x+0.303 1，r2=0.990 8。

10個空白孔OD±3SD(標準差)計算抗原濃度0.666 8 ng/ml，即最低檢測限為 0.666 8 ng/ml。

在線性范圍內(nèi)取高(20 ng/ml)、中(10 ng/ml)、低(1 ng/ml)3個抗原濃度，測定其OD值，計算其平均回收率為98.14%，如表3。

2.4 特異性檢測 以角蛋白CK8、CK18、絨毛促性腺激素(HCG)、促卵泡激素(FSH)為抗原進行雙抗體夾心 ELISA法檢測，對比檢測結果證實:CYFRA21-1與其他各類物質(zhì)之間無交叉反應，證明其特異性較好。

表3 不同抗原濃度下對應的回收率Tab.3 Recovery of different concentration of CYFRA21-1

2.5 精密性測定 通過高(20 ng/ml)、中(10 ng/ ml)、低(1 ng/ml)3個抗原濃度，在同一塊板上測定(批內(nèi))、在不同包被板上檢測(批間)OD值變化，計算出批內(nèi)精密性(變異系數(shù)CV＜6.8%)和批間精密性(變異系數(shù)CV＜11.4%)，如表4。說明建立的檢測方法具有較好的重復性。

2.6 試劑盒對比驗證試驗 應用建立的雙抗體夾心ELISA檢測方法檢測收集的53份陽性血清，其檢測結果與購買的CYFRA21-1檢測試劑盒的檢測結果進行比較，結果如圖2所示。

結果顯示，本實驗條件下制備并經(jīng)配對實驗選擇的兩對單克隆抗體與試劑盒對比相關性良好，r=0.956 1，P ＜ 0.001，回歸方程:y=0.959 4x+ 0.080 9，r2=0.914 2。

表4 精密性測定結果Tab.4 Results of precision detection

20 2.311 ±0.007 6.5 2.289 ±0.008 9.1

圖2 試劑盒和構建的雙抗體夾心法檢測濃度結果對比Fig.2 Results of double antibody sandwich ELISA compare with kits

3 討論

肺癌是常見的惡性腫瘤，死亡率居各類惡性腫瘤之首位，且發(fā)病率逐年上升，由于CYFRA21-1在非小細胞肺癌中表達量較高[7]，因此，對于與肺良性疾病鑒別較為困難、且不能手術的非小細胞肺癌來說，研發(fā)CYFRA21-1的診斷試劑盒，對該病進行早期診斷、早期治療是提高肺癌患者生存的主要手段。

目前，國內(nèi)CYFRA21-1的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法、電化學發(fā)光法、免疫熒光法、液體芯片技術等。王雅杰等[8]采用液體芯片技術檢測血清中CYFRA21-1水平，與ELISA、電化學發(fā)光技術的一致率達到 90.2%、77.2%;楊恩環(huán)等[9]采用流式熒光法檢測多種腫瘤標志物，與 ELISA試劑盒相比，流式熒光法的檢測線性范圍更寬，而靈敏度與電化學發(fā)光法一致;王彪等[10]自制的CYFRA21-1時間分辨熒光免疫分析試劑盒進行臨床檢測評價，與Roche電化學發(fā)光試劑盒陽性符合率為97.40%?？梢钥闯?，新的技術和方法為CYFRA21-1的檢測提供高通量、快捷、便利的方法，但酶聯(lián)免疫的ELISA檢測以其較高的靈敏度、較寬的線性檢測范圍和操作簡捷，成為各種檢測方法中的經(jīng)典方法。

在實驗中我們發(fā)現(xiàn)，以2F9株單克隆抗體為包被抗體、6F11株單克隆抗體為酶標抗體，采用棋盤法建立雙抗體夾心ELISA檢測方法時，當包被抗體濃度高于50 ng/ml時，OD值降低，說明包被抗體的濃度對血清CYFRA21-1含量的檢測有一定的影響，可能存在過量的抗原抗體結合物影響標記抗體的結合，從而影響顯色和抗原濃度的測定，因此，我們將CYFRA21-1抗原進行不同梯度的稀釋，測定其與OD值之間的相關性，得出以下結論:CYFRA21-1抗原在0.7～25 ng/ml范圍內(nèi)，與測定的OD值呈線性關系，當?shù)陀诨虺^這個范圍，OD值均有所偏差，不能代表抗原濃度的實際值。

本實驗在自制單克隆抗體的基礎上(結果另見報道)，利用單克隆抗體的高度敏感性，建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法，能夠在0.7～25 ng/ml范圍內(nèi)較好地檢測正常人血清中CYFRA21-1的含量，且最低檢測限達到0.666 8 ng/ml，其特異性與精密性均較好，對于后期應用于臨床檢測正常與病理人群的血清水平奠定基礎。該方法也為上皮癌的診斷、病程發(fā)展、療效觀察、用藥指導及愈后提供了輔助性的指導。

[1]Boeck S，Wittwer C，Heinemann V，et al.Cytokeratin 19-fragments(CYFRA 21-1)as a novel serum biomarker for response and survival in patients with advanced pancreatic cancer[J].Br J Caner，2013，108(8):1684-1694.

[2]Pang L，Wang J，Jiang Y，et al.Decreased levels of serum cytokeratin 19 fragment CYFRA 21-1 predict objective response to chemotherapy in patients with non-small cell lung cancer[J].Exp Ther Med，2013，6(2):355-360.

[3]Park SY，Lee JG，Kim J，et al.Preoperative serum CYFRA 21-1 level as a prognostic factor in surgically treatedadenocarcinoma of lung[J].Lung Cancer，2013，79(2):156-160.

[4]Okamura K，Takayama K，Izumi M，et al.Diagnostic value of CEA and CYFRA 21-1 tumor markers in primary lung cancer[J].Lung Cancer，2013，80(1):45-49.

[5]Liu L，Liu B，Zhu LL.CYFRA21-1 as a serum tumor marker for follow-up patients with squamous cell lung carcinoma and oropharynx squamous cell carcinoma[J].Biomark Med，2013，7(4): 591-599.

[6] 顏子穎，王海林等譯.精編分子生物學實驗指南[M].北京:科學出版社，1998:413-415.

[7]Jiro Fujita，Kazutaka Dohmoto，Satoko Hojo，et al.The point mutation in the promoter region and the single nucleotide polymorphism in exon 1 of the cytokeratin 19 gene in human lung cancer cell lines[J].Lung Cancer，2001，34:387-394.

[8]王雅杰，張 錕，方 芳，等.應用液體芯片技術聯(lián)合檢測癌胚抗原、19片段角蛋白和神經(jīng)元特異性烯醇化酶對于肺癌診斷價值的研究[J].中國實驗診斷學，2006，10(6):588-592.

[9]楊恩環(huán)，周宇瓊.流式熒光法檢測多腫瘤標志物性能評估及臨床應用[J].臨床檢驗雜志，2012，30(12):960-963.

[10]王 彪，崔曉丙，張國蘭，等.細胞角蛋白19片斷時間分辨熒光免疫分析試劑盒的評價及臨床應用研究[J].熱帶醫(yī)學雜志，2008，8(1):6-11.

[收稿2013-12-01 修回2014-01-03]

(編輯 張曉舟)

Preparation and preliminary application of double antibody sandwich ELISA for CYFRA21-1

ZHANG Hui-Ru，ZHAI Jin-Yu，WANG Xue-Qin，LIU Zhen，WANG Yun-Long，MI Hai.Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China

Objective:To establish the detection method of double-antibody sandwich ELISA about CYFRA21-1 in human serum.MethodsThe paired antibody were screened among four strains mAbs of CYFRA21-1，which was marked by sodium periodate method.The detecting method of double antibody sandwich ELISA was optimizted，and evaluated by specificity，stability and sensitivity.ResultsThe results showed that a paired of antibody，which was 2F9 as the coated antibody and 6F11 as the labeled antibody，was selected from four mAbs.It was the optimum condition of double antibody sandwich ELISA that the coating antigen concentration of 2F9 was 0.50 μg/ml，while the labeled antibody of 6F11 was diluted 6 000 times.The linear range of standard curve was 0.7-25 ng/ ml with r2=0.990 8，while the limit of detection was 0.666 8 ng/ml，the recovery rate was 98.14%.The cross-reactions with the other analogues in serum were less than 0.1%.The coefficient of variation in group(n=10)was 6.8%，whereas coefficient of variation among group(n=5)was 11.4%.The correlation compared with other foreign ELISA kit was 91.42%.ConclusionIn brief，we successfully established the method of double antibody sandwich ELISA detecting CYFRA21-1 level in human serum，laying the foundation for the production of CYFRA21-1 ELISA kit.

CYFRA21-1;Double antibody sandwich ELISA;Lung cancer;Detection kit

R446.6

A

1000-484X(2014)05-0644-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.016

①本文受河南省重點攻關項目(132102310169、102102310093、102102310082)資助。

②河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng)453007。

張慧茹(1967年－)，女，博士，碩士生導師，主要從事疾病診斷檢測技術方面的研究，E-mail:zhr67@163.com。