軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1誘導(dǎo)的瘢痕成纖維細(xì)胞體內(nèi)成軟骨能力的實(shí)驗(yàn)研究

沈聰聰 柴 崗 曲 淼 侯亦康 許祐榮 張 艷

軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1誘導(dǎo)的瘢痕成纖維細(xì)胞體內(nèi)成軟骨能力的實(shí)驗(yàn)研究

沈聰聰 柴 崗 曲 淼 侯亦康 許祐榮 張 艷

目的探討軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1（CDMP1）誘導(dǎo)的瘢痕成纖維細(xì)胞在體內(nèi)環(huán)境下的軟骨構(gòu)建能力。方法取瘢痕切除術(shù)后丟棄的增生性瘢痕組織，提取瘢痕成纖維細(xì)胞。將瘢痕成纖維細(xì)胞與PGA/PLA支架復(fù)合，CDMP1軟骨誘導(dǎo)液（CDMP1終濃度為100 ng/mL）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)2周，設(shè)為誘導(dǎo)組（n=10）；將常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞－材料復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi)作為陰性對(duì)照，設(shè)為非誘導(dǎo)組（n=4）；將軟骨細(xì)胞－材料復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi)作為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)為軟骨組（n=4）。分別于4周和8周后取材，進(jìn)行各組濕重、糖胺聚糖（GAG）含量測(cè)定，HE染色、Safranine-O染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色。結(jié)果體內(nèi)培養(yǎng)4周、8周后各組濕重、GAG含量測(cè)定顯示，誘導(dǎo)組均高于非誘導(dǎo)組（P＜0.05）。體內(nèi)培養(yǎng)4周后，誘導(dǎo)組HE染色結(jié)果顯示，瘢痕成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)后出現(xiàn)軟骨細(xì)胞陷窩結(jié)構(gòu)；Safranine-O染色結(jié)果示，GAG均勻分布于基質(zhì)；免疫組織化學(xué)染色示部分瘢痕成纖維細(xì)胞基質(zhì)中COLⅡ陽(yáng)性表達(dá)。8周時(shí)，誘導(dǎo)組的類軟骨結(jié)果相對(duì)4周時(shí)更加成熟，更加符合軟骨結(jié)構(gòu)分布。結(jié)論在CDMP1誘導(dǎo)下，瘢痕成纖維細(xì)胞與PGA/PLA材料復(fù)合，在體內(nèi)可以形成類軟骨組織，具備一定的成軟骨能力。

瘢痕成纖維細(xì)胞軟骨細(xì)胞軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白1誘導(dǎo)分化

軟骨缺損的治療一直是整形外科面臨的嚴(yán)峻問(wèn)題。目前，臨床上常用的替代治療手段均存在許多問(wèn)題。自體軟骨細(xì)胞移植修復(fù)也存在細(xì)胞供區(qū)不足、體外培養(yǎng)周期長(zhǎng)、供區(qū)易發(fā)生病變和軟骨細(xì)胞表型不易保持等缺點(diǎn)。組織工程技術(shù)的建立為修復(fù)和替代受損組織提供了一種新的方法。

研究發(fā)現(xiàn)，真皮成纖維細(xì)胞具有多向分化潛能[1]，并能誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞[2-3]。大面積燒傷伴軟骨缺損的患者，皮源緊張，但有大量廢棄的瘢痕組織，而瘢痕成纖維細(xì)胞與皮膚成纖維細(xì)胞同樣具有強(qiáng)大的體外增殖能力及基質(zhì)分泌能力，能夠分泌大量膠原及細(xì)胞外基質(zhì)，為軟骨組織構(gòu)建提供了契機(jī)。

本研究的前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，瘢痕成纖維細(xì)胞在體外單層培養(yǎng)和三維環(huán)境下均可向軟骨細(xì)胞表型分化，并具備一定的軟骨分化潛能[4]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將瘢痕成纖維細(xì)胞與PGA/PLA生物材料的復(fù)合物植入體內(nèi)，探討其在體內(nèi)環(huán)境下的成軟骨能力。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Ⅰ型膠原酶（Worthington公司，美國(guó)）；FBS基礎(chǔ)培養(yǎng)液、DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司，美國(guó)）；胰蛋白酶（上海實(shí)生生物制品有限公司）；CDMP1（Research Diagnostics公司，美國(guó)）；鼠抗人I型膠原單克隆抗體、羊抗鼠二抗（Santa公司，美國(guó)）。

恒溫CO2培養(yǎng)箱（Forma Scientific公司，美國(guó)）；普通臺(tái)式離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)（Heraeus公司，美國(guó)）；倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；電泳儀（天能科技有限公司）；熱循環(huán)儀（Biometra公司，美國(guó)）；100 mm培養(yǎng)皿、離心管（FALCON公司，美國(guó)）。

1.2 取材與細(xì)胞培養(yǎng)

取我科手術(shù)切除瘢痕3例（1名男性，2名女性，年齡7～20歲，獲患者知情同意），超凈臺(tái)內(nèi)去除表皮及皮下組織，剩余瘢痕增生部分剪碎移入離心管，加入10倍體積的0.3%Ⅰ型膠原酶，37℃、3 h、100目細(xì)胞濾器過(guò)濾后離心，2 000 r/min，10 min，棄上清，加入10%FBS的DMEM培養(yǎng)液混浴，接種至100 mm的培養(yǎng)皿。待細(xì)胞融合至80%時(shí)，以1×104cells/cm2密度傳代，體外擴(kuò)增至第4代進(jìn)行培養(yǎng)。

取手術(shù)廢棄的部分肋軟骨（獲患者知情同意），分離軟骨細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 PGA/PLA支架材料的制作

取無(wú)紡PGA纖維加入1.5%的PLA二氯乙烷溶液約0.4 mL，待其自然干燥后取出，真空保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞接種和誘導(dǎo)

配制CDMP1誘導(dǎo)液（2%胎牛血清F-12培養(yǎng)液，CDMP1終濃度為100 ng/mL）。各組細(xì)胞懸液0.3 mL均勻種植于PGA/PLA支架上，于37℃、5%CO2、100%飽和濕度下培養(yǎng)4～5 h后，加入含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。3 d后換為軟骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)2周。同時(shí)，制備軟骨細(xì)胞-材料復(fù)合物。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和手術(shù)回植

6周齡雄性裸鼠20只，麻醉意外死亡2只，共18只用于實(shí)驗(yàn)。將CDMP1體外誘導(dǎo)后的細(xì)胞材料復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi)，為誘導(dǎo)組，10只；將常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞－材料復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi)作為陰性對(duì)照，為非誘導(dǎo)組，4只；將軟骨－細(xì)胞材料復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi)作為陽(yáng)性對(duì)照，為軟骨組，4只。隨機(jī)分組，裸鼠背部表面麻醉，正中作約1 cm長(zhǎng)度切口，向兩側(cè)分離，使皮膚與皮下組織分離，將體外培養(yǎng)的細(xì)胞－材料復(fù)合物植入裸鼠皮下，左側(cè)為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)陰性對(duì)照組，背部中央為陽(yáng)性對(duì)照組，絲線縫合傷口。

1.6 術(shù)后大體觀及濕重測(cè)定

分別于4周和8周后取材，比較各組標(biāo)本大小、外形及彈性，并對(duì)各組標(biāo)本濕重進(jìn)行測(cè)量。

1.7 GAG含量測(cè)定

取材后對(duì)細(xì)胞－材料復(fù)合物進(jìn)行檢測(cè)，將復(fù)合物于去污裂解液中剪碎，經(jīng)鹽酸胍等處理后，以阿利辛藍(lán)染色并沉淀，經(jīng)DMSO溶解后在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值，以硫酸軟骨素繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)比色結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本內(nèi)GAG的含量。

1.8 組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色

取材后收集樣本，10%磷酸緩沖福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片。以HE、safranin-O染色及免疫組化染色，分別顯示復(fù)合物的組織學(xué)形態(tài)和軟骨特異指標(biāo)的分布。

1.8.1 HE染色

切片脫蠟入水后，PBS漂洗，蘇木素染色20 min，水洗，1%鹽酸乙醇分化，再水洗脫水，伊紅染料染色，乙醇梯度脫水，樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.8.2 Safranin-O染色

取材后，切片脫蠟至水，蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化5 sec（提插數(shù)下），自來(lái)水沖洗15 min，Safranin-O染色10 min，快速水洗20 sec，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察。

1.8.3 免疫組織化學(xué)

將切片脫蠟至水；PBS漂洗3次，3%過(guò)氧化氫溶液封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS漂洗，0.4%胃蛋白酶（pH 2.0）37℃消化30 min，正常羊血清（用1% BSA進(jìn)行1∶10稀釋）室溫下孵育30 min封閉非特異性抗原；加入鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體（1% BSA 1∶100稀釋）4℃過(guò)夜，PBS漂洗；加入HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗，37℃孵育30 min，PBS漂洗；加入二氨基聯(lián)苯氨（DAB）顯色；蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片。以不加鼠抗人Ⅱ型膠原單克隆抗體作為空白對(duì)照，正常軟骨組織為陽(yáng)性對(duì)照。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS v1.15。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞材料復(fù)合物大體觀及濕重檢測(cè)

大體觀察：體內(nèi)培養(yǎng)4周后，所有的復(fù)合物均變得相對(duì)光滑，外觀光澤。誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組稍有皺縮，基本保持了材料的原有形態(tài)。誘導(dǎo)組直徑約4.5 mm，形狀良好，觸之有一定彈性；非誘導(dǎo)組雖能保持一定外觀，但基質(zhì)分泌較少，韌性較差，質(zhì)地較松軟；軟骨組生長(zhǎng)良好，基質(zhì)分泌旺盛，形狀規(guī)則，外觀均呈乳白色，有彈性。濕重測(cè)定示，軟骨組為92.75±1.53 mg，誘導(dǎo)組為75.69±0.97 mg，非誘導(dǎo)組為43.21±0.43 mg，3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

體內(nèi)培養(yǎng)8周后，誘導(dǎo)組呈現(xiàn)特有的軟骨光澤，較體內(nèi)培養(yǎng)4周有所成熟；非誘導(dǎo)組質(zhì)地松軟，生長(zhǎng)欠佳；軟骨組生長(zhǎng)良好。濕重測(cè)定示，軟骨組為101.24±2.53 mg，誘導(dǎo)組為80.09±1.27 mg，非誘導(dǎo)組為35.15±2.03 mg，3組差異顯著（P＜0.05）（圖1、2）。

圖1 細(xì)胞材料復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)4周后大體觀及濕重測(cè)定Fig.1 Gross view and the wet weight of HSFBs-PGA/PLA complex in each group after cultured for 4 weeks in vivo

圖2 細(xì)胞材料復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)8周后大體觀及濕重測(cè)定Fig.2 Gross view and the wet weight of HSFBs-PGA/PLA complex in each group after cultured for 8 weeks in vivo

2.2 GAG定量檢測(cè)

HSFBs-PGA/PLA復(fù)合物植入體內(nèi)4周、8周后行GAG含量測(cè)定。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組GAG含量均明顯高于非誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)組與非誘導(dǎo)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 體內(nèi)培養(yǎng)4、8周后各組GAG定量檢測(cè)Table1 GAG content in each group after cultured for 4 or 8 weeks in vivo

2.3 組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色

2.3.1 HE染色

細(xì)胞－材料復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)4周后取材，HE染色顯示，軟骨組與正常軟骨組織的組織學(xué)特征十分接近，形成了成熟連續(xù)的軟骨組織，可見到大量成熟的軟骨陷窩，無(wú)纖維組織形成，但新生軟骨內(nèi)部的組織結(jié)構(gòu)均較周邊松散，可見到尚未降解的支架材料。誘導(dǎo)組細(xì)胞材料復(fù)合物以纖維性組織為主，較為緊密，部分區(qū)域可見到軟骨樣組織，部分細(xì)胞出現(xiàn)陷窩結(jié)構(gòu)；非誘導(dǎo)組呈現(xiàn)均一的纖維樣結(jié)構(gòu)，組織結(jié)構(gòu)松散，鏡下未發(fā)現(xiàn)軟骨特征性陷窩結(jié)構(gòu)。體內(nèi)培養(yǎng)8周后HE染色顯示，誘導(dǎo)組部分細(xì)胞出現(xiàn)陷窩結(jié)構(gòu)，非誘導(dǎo)組鏡下未發(fā)現(xiàn)軟骨特征性陷窩結(jié)構(gòu)（圖3）。

圖3 細(xì)胞-材料復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)4周后各組組織學(xué)及免疫組織化學(xué)觀察Fig.3 Histological and immunohistochemical observation of each group after culturing for 4 weeks in vivo

2.3.2 Safranine-O染色

細(xì)胞－材料復(fù)合物誘導(dǎo)4周后取材，Safranine-O染色顯示，誘導(dǎo)組陽(yáng)性染色，著色均一，相對(duì)軟骨組著色稍淺；非誘導(dǎo)組著色陰性；軟骨組著色呈強(qiáng)陽(yáng)性，著色均一，提示大量GAG分泌。8周后取材行Safranine-O染色，軟骨組著色均一，強(qiáng)陽(yáng)性；誘導(dǎo)組均勻染色，相對(duì)軟骨組著色稍淺，提示GAG均勻分布于基質(zhì)；非誘導(dǎo)組著色陰性（圖3）。

2.3.3 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)

細(xì)胞－材料復(fù)合物誘導(dǎo)4周后取材，免疫組織化學(xué)染色顯示誘導(dǎo)組部分區(qū)域出現(xiàn)陽(yáng)性著色，著色相對(duì)不均一，提示部分瘢痕成纖維細(xì)胞出現(xiàn)COLⅡ的表達(dá)；非誘導(dǎo)組免疫組化染色呈現(xiàn)陰性結(jié)果；軟骨組染色結(jié)果呈陽(yáng)性，著色均勻。誘導(dǎo)8周后，誘導(dǎo)組部分區(qū)域著色陽(yáng)性；非誘導(dǎo)組免疫組化染色呈陰性；軟骨組細(xì)胞染色強(qiáng)陽(yáng)性，著色均勻（圖4）。

圖4 細(xì)胞-材料復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)8周后各組組織學(xué)及免疫組織化學(xué)觀察Fig.4 Histological and immunohistochemical observation of each group after culturing for 8 weeks in vivo

3 討論

由于軟骨的再生能力很有限，軟骨缺損的修復(fù)一直是臨床治療的難題。傳統(tǒng)的治療方法，如軟骨下打孔、骨髓刺激法、軟骨膜移植法或使用人工代用品都存在一定的缺點(diǎn)，并不能完全修復(fù)透明軟骨的原有結(jié)構(gòu)。組織工程的發(fā)展，使組織構(gòu)建成為可能，為軟骨缺損的修復(fù)提供了新的方法及思路。

綜合考慮來(lái)源、取材的創(chuàng)傷以及誘導(dǎo)分化的效率問(wèn)題，我們需要尋找一種來(lái)源廣泛，能夠向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，而且更容易為患者所接受的種子細(xì)胞。真皮成纖維細(xì)胞在機(jī)體分布廣泛、取材方便、增殖力強(qiáng)，已成為當(dāng)前組織工程種子細(xì)胞研究的重點(diǎn)[5]。與軟骨細(xì)胞不同的是，真皮成纖維細(xì)胞保留了中胚層間質(zhì)細(xì)胞增殖力強(qiáng)的特性，多次傳代后仍能保持強(qiáng)大增殖力。對(duì)于臨床上大面積燒傷伴軟骨缺損的患者而言，患者皮源緊張，無(wú)多余皮膚可取，切取正常皮膚亦會(huì)增加感染風(fēng)險(xiǎn)，患者很難接受。研究證明，瘢痕成纖維細(xì)胞（HSFBs）與DFs同樣具有強(qiáng)大的體外增殖能力及基質(zhì)分泌能力，能夠分泌大量膠原及蛋白聚糖。同時(shí)，HSFBs具有部分干細(xì)胞的特性，在特定條件下能夠表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物。Yang等[6]提取瘢痕疙瘩中的成纖維細(xì)胞，在特定誘導(dǎo)條件下發(fā)現(xiàn)瘢痕成纖維細(xì)胞具有干細(xì)胞樣分化潛能，能夠表達(dá)神經(jīng)角質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物，并能夠向神經(jīng)細(xì)胞分化誘導(dǎo)。Moon等[7]從頭皮瘢痕中分離瘢痕成纖維細(xì)胞，采用各種誘導(dǎo)體系對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)，結(jié)果顯示瘢痕成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物CD13、CD29、CD44、CD90等，并能夠向骨組織細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱細(xì)胞及上皮細(xì)胞等方向分化，證明了瘢痕成纖維細(xì)胞具有多向分化潛能。

軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白（CDMP1，cartilage-derived morphogenetic protein1）是骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP，bone morphogenetic protein）家族中的一類特異性生長(zhǎng)因子，是與軟骨形態(tài)發(fā)生和發(fā)育最為相關(guān)的一類生長(zhǎng)因子，CDMP1主要通過(guò)調(diào)節(jié)間質(zhì)前體細(xì)胞的分化，參與正常軟骨組織的生長(zhǎng)并促進(jìn)軟骨損傷的修復(fù)過(guò)程[8-9]。研究表明，CDMP1能夠誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨表型分化并表達(dá)特異性軟骨基質(zhì)[10]，而瘢痕成纖維細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，具有向軟骨細(xì)胞分化的潛能。因此，本實(shí)驗(yàn)采用軟骨形態(tài)發(fā)生蛋白作為誘導(dǎo)劑。而進(jìn)行組織工程軟骨構(gòu)建，生物支架材料是必不可少的一個(gè)因素。支架材料對(duì)軟骨組織的形成具有重要作用，它能夠?yàn)榧?xì)胞提供一個(gè)穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，便于細(xì)胞黏附生長(zhǎng)[11]。理想的支架材料應(yīng)具備以下特點(diǎn)[12]：良好的生物相容性，良好的生物降解性，具有三維立體多孔結(jié)構(gòu)，以及一定的可塑性和機(jī)械強(qiáng)度。Grande等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，PGA/ PLA支架材料具有促進(jìn)蛋白聚糖合成，促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、分化和基質(zhì)合成的作用。

本研究中，細(xì)胞-材料復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)4周后，大體觀察發(fā)現(xiàn)，軟骨組外觀類似于軟骨組織，基質(zhì)分泌旺盛，皺縮不明顯，有彈性，外形尚基本保持。誘導(dǎo)組外觀良好，稍有皺縮，觸之略有彈性，但相對(duì)軟骨組稍差，組織塊直徑及厚度略有減小，外形尚能保持；非誘導(dǎo)組細(xì)胞材料復(fù)合物皺縮變形，結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，厚度也明顯變薄，無(wú)法保持原有外形，彈性較差，與軟骨組差距明顯。8周標(biāo)本大體觀發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)組基質(zhì)進(jìn)一步增加，外觀良好，相對(duì)4周而言，軟骨光澤及光滑程度明顯增加。而非誘導(dǎo)組雖重量和光滑程度增加，但結(jié)構(gòu)相對(duì)松散，彈性較差，抗外力能力明顯不足。各組細(xì)胞-材料復(fù)合物的濕重及GAG含量檢測(cè)表明，隨著體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組濕重及GAG含量均進(jìn)一步增加，而誘導(dǎo)組在濕重及GAG定量測(cè)定中均優(yōu)于非誘導(dǎo)組，差異有統(tǒng)計(jì)意義。4周取材HE染色顯示，軟骨組與正常軟骨組織的組織學(xué)特征十分接近，形成了連續(xù)的軟骨組織，可見到大量的軟骨陷窩，軟骨細(xì)胞之間大量基質(zhì)分泌，無(wú)明顯纖維組織形成。誘導(dǎo)組細(xì)胞材料復(fù)合物結(jié)構(gòu)較為緊密，部分區(qū)域可見到軟骨樣組織，細(xì)胞出現(xiàn)陷窩結(jié)構(gòu)，陷窩結(jié)構(gòu)在細(xì)胞材料復(fù)合物邊緣多于中央，中央大部分區(qū)域仍可見到大量纖維組織形成；非誘導(dǎo)組呈現(xiàn)彌散的纖維性組織，組織結(jié)構(gòu)松散，鏡下未發(fā)現(xiàn)明顯軟骨特征性陷窩結(jié)構(gòu)。8周標(biāo)本相對(duì)4周標(biāo)本而言更為成熟，細(xì)胞間基質(zhì)增加，誘導(dǎo)組結(jié)構(gòu)更加緊密，軟骨陷窩數(shù)量增多，陷窩結(jié)構(gòu)更加明顯，更加符合軟骨結(jié)構(gòu)分布。非誘導(dǎo)組未見到明顯變化，仍為纖維性結(jié)構(gòu)為主，未見軟骨組織特征性結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。COLⅡ?yàn)檐浌羌?xì)胞特異標(biāo)志物，對(duì)細(xì)胞材料復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)4周后進(jìn)行COLⅡ免疫組織化學(xué)染色，誘導(dǎo)組部分區(qū)域出現(xiàn)陽(yáng)性著色，著色相對(duì)均一，提示部分瘢痕成纖維細(xì)胞出現(xiàn)COLⅡ的表達(dá)；非誘導(dǎo)組免疫組化染色結(jié)果呈現(xiàn)陰性結(jié)果，未有COLⅡ的表達(dá)；軟骨組細(xì)胞染色結(jié)果呈陽(yáng)性，整個(gè)細(xì)胞材料著色均勻，提示COLⅡ的高度表達(dá)。體內(nèi)培養(yǎng)8周細(xì)胞材料復(fù)合物COLⅡ免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，誘導(dǎo)組部依然為陽(yáng)性著色，著色均一，與非誘導(dǎo)組的陰性結(jié)果形成明顯對(duì)比。Safranine-O染色的結(jié)果同樣驗(yàn)證了上述結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在CDMP1誘導(dǎo)下，瘢痕成纖維細(xì)胞在體內(nèi)可以形成類軟骨組織，具備一定的體內(nèi)成軟骨能力，經(jīng)過(guò)4周誘導(dǎo)后瘢痕成纖維細(xì)胞形成的類軟骨組織相對(duì)成熟，體內(nèi)培養(yǎng)8周后的細(xì)胞材料復(fù)合物較4周更加成熟，雖然與正常軟骨仍有一定差距，但在外形和結(jié)構(gòu)上更加接近軟骨組取材標(biāo)本。隨著培養(yǎng)時(shí)間和實(shí)驗(yàn)條件的改善，瘢痕成纖維細(xì)胞有望在體內(nèi)構(gòu)建更加成熟穩(wěn)定的軟骨組織，成為軟骨構(gòu)建的種子細(xì)胞來(lái)源之一。

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ChondrogenicDifferentiationofHypertrophicScar-DerivedFibroblastsInitiatedbyCartilage-derived Morphogenetic Protein 1 in Vivo

SHEN Congcong,CHAI Gang,QU Miao,HOU Yikang,XU Yourong,ZHANG Yan.

Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,200011 Shanghai,China.Corresponding author:Zhang Yan(E-mail:13651817522@163.com).

ObjectiveTo explore the chondrogenesis potential of hypertrophic scar fibroblasts(HSFBs)induced by cartilage-derived morphogenetic protein 1(CDMP1)in vivo.MethodsHypertrophic scar fibroblasts(HSFBs)were isolated from discarded hypertrophic scar.HSFBs combining with PGA/PLA scaffold as HSFBs-PGA/PLA complex were induced by CDMP1(100 ng/mL)for 2 weeks.Then the complex were transplanted into nude mice as induced group(n=10).The complex that not induced were treated as negative control,named as un-induced group(n=4),while the chondrocytes-PGA/PLA complex were treated as positive control,named as chondrocyte group(n=4).After 4 and 8 weeks,the complex in each group was harvested for wet weight test,proteoglycan(GAG)content test,HE staining,Safranine-O staining and immunochemistry staining.ResultsAfter 4 and 8 weeks in vivo,the wet weight and GAG content in induced group were both higher than in un-induced group(P＜0.05).In induced group,after cultured for 4 weeks in vivo,chondrocyte-like lacuna structure was observed by HE staining,uniform distribution of GAG was observed by Safranine-O staining,and positive expression of collagen typeⅡwas revealed by immunohistochemical staining.After 8 weeks of culturing in vivo,chondrocyte-like structure in induced group was more mature and more in line with the structure distribution of cartilage.ConclusionHSFBs combining with PGA/PLA had the potential to develop into polygonal chondrocyte-like tissue by the induction of CDMP 1.

Hypertrophic scar fibroblasts;Chondrocytes;Cartilage-derived morphogenetic protein 1; Transdifferention

Q813.1+2

A

1673－0364（2014）06－0324－05

2014年10月11日；

2014年11月6日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.06.006

上海市科委自然科學(xué)基金（12ZR1416900）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

張艷（E-mail：13651817522@163.com）。