人脂肪來源干細(xì)胞與左旋聚乳酸/聚己內(nèi)酯支架的體內(nèi)外生物相容性研究

姚海軍 趙 陽 周 哲 肖冬冬 周 娟 張 明 王 忠 何創(chuàng)龍 盧慕峻

人脂肪來源干細(xì)胞與左旋聚乳酸/聚己內(nèi)酯支架的體內(nèi)外生物相容性研究

姚海軍 趙 陽 周 哲 肖冬冬 周 娟 張 明 王 忠 何創(chuàng)龍 盧慕峻

目的觀察人脂肪來源干細(xì)胞（Human adipose－derived stem cells，hA D SCs）在左旋聚乳酸/聚己內(nèi)酯（Poly-L-lactide/Polycaprolactone，PLLA/PCL）復(fù)合支架材料中的生長情況及其生物相容性。方法體外分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增hA D SCs，制備PLLA/PCL復(fù)合支架。取PLLA/PCL浸提液培養(yǎng)hADSCs，CCK-8法檢測細(xì)胞活力，評價支架的細(xì)胞毒性。hADSCs傳代擴(kuò)增后，接種到PLLA/PCL支架材料上。體外培養(yǎng)1周，裸鼠皮下分別培養(yǎng)1周、2周，HE染色觀察細(xì)胞在支架上的生長情況。免疫熒光檢測裸鼠體內(nèi)復(fù)合支架材料內(nèi)細(xì)胞平滑肌肌動蛋白（Smooth muscle actin，SMA）表達(dá)情況。結(jié)果hADSCs在PLLA/PCL浸提液中可保持較高的增殖率，表明PLLA/PCL浸提液無細(xì)胞毒性。hA D SCs接種于PLLA/PCL支架上，經(jīng)體外、體內(nèi)培養(yǎng)后，均能長入PLLA/PCL支架的孔隙內(nèi)，且體內(nèi)培養(yǎng)比體外培養(yǎng)有更多的細(xì)胞長入支架內(nèi)部。經(jīng)體內(nèi)培養(yǎng)后，復(fù)合細(xì)胞的支架比單純支架有更多的細(xì)胞滲入支架內(nèi)部。細(xì)胞材料復(fù)合物體內(nèi)培養(yǎng)2周后，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，支架材料內(nèi)部分細(xì)胞SMA表達(dá)陽性。結(jié)論P(yáng)LLA/PCL復(fù)合支架材料，安全無毒，與hA D SCs生物相容性好，可作為種子細(xì)胞的載體用于組織工程膀胱缺損修復(fù)的研究。

人脂肪來源干細(xì)胞左旋聚乳酸聚己內(nèi)酯生物相容性

膀胱腫瘤、結(jié)核、神經(jīng)源性膀胱以及一些先天性膀胱疾?。ㄈ绨螂淄夥┒伎蓪?dǎo)致膀胱缺損，需進(jìn)行膀胱修復(fù)。利用胃腸道替代膀胱是目前最常用的方法，但存在著諸多并發(fā)癥，如結(jié)石、腫瘤、電解質(zhì)紊亂等，且會造成供區(qū)損傷，如腸梗阻、腸瘺和尿瘺等。近年來利用組織工程技術(shù)進(jìn)行膀胱修復(fù)重建的實驗和臨床研究逐年增加[1-2]。目前，大部分膀胱組織工程重建研究都采用種子細(xì)胞復(fù)合支架材料的方法。脂肪來源干細(xì)胞（A dipose-derived stem cells，ADSCs）具有自我更新及多向分化潛能，能夠向平滑肌細(xì)胞、尿路上皮樣細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞等分化，并可分泌多種生長因子，具有來源豐富、取材方便、安全等優(yōu)勢，是具有巨大研究潛力和廣闊臨床應(yīng)用前景的種子細(xì)胞源。左旋聚乳酸（Poly-L-lactide，PLLA）和聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）都是人工合成聚合材料，安全無毒，是FDA認(rèn)可的生物材料[3-4]。但是PLLA的分子鏈呈剛性，脆性太高，親水性差[5-6]，而PCL的分子鏈較軟，具有良好的柔韌性和可加工性，親水性強(qiáng)，但降解速度過慢[7-8]。研究表明，單一成分材料難以滿足膀胱組織工程重建的要求，但可以利用PCL對PLLA進(jìn)行改性，聯(lián)合兩種材料的優(yōu)勢，制備符合膀胱重建需求的復(fù)合型支架。本實驗將hADSCs置于PLLA/PCL浸提液中培養(yǎng)，檢測PLLA/ PCL的細(xì)胞毒性，并將hADSCs種植于PLLA/PCL支架上，進(jìn)行體內(nèi)、外培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長情況。進(jìn)一步探討PLLA/PCL作為hADSCs的支架材料用于組織工程膀胱缺損修復(fù)的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗研究得到上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。hADSCs取自我院整復(fù)外科抽脂術(shù)后廢棄的人脂肪組織，并獲患者知情同意。PLLA（寧波環(huán)球塑料制品有限公司），PCL（上海天清材料有限公司），PLLA-PCL復(fù)合支架由東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院制備并提供。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs的分離培養(yǎng)

將抽脂術(shù)后廢棄的人脂肪組織用PBS沖洗3遍，洗去血液和麻醉液。加入等體積的0.075%的膠原酶Ⅳ，37℃恒溫振蕩消化1 h，1 500 r/min，5 min，37℃離心，去除懸浮的脂肪和上清液，加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，并置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液1次，以后每3天換液1次。4~6 d細(xì)胞生長融合達(dá)80%~90%后，0.25%胰酶-EDTA消化，按1∶3進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 PLLA/PCL支架的制備及掃描電鏡觀察

將PLLA與PCL按照質(zhì)量比3∶1混合后，利用熱致相分離技術(shù)得到多孔PLLA-PCL聚合物復(fù)合支架，PLLA/PCL孔徑約40μm，孔隙率約為90%，孔間連通性較好。將材料制備成10 mm×10 mm，厚2 mm的補(bǔ)片，乙醇消毒備用。將上述方法制備得到的PLLA-PCL支架噴金鍍膜，在液氮中脆斷，噴金處理，掃描電鏡觀察。

1.2.3 hADSCs在PLLA-PCL浸提液中增殖率測定

PLLA-PCL支架用75%乙醇浸泡消毒過夜，PBS洗去殘留乙醇，并加入低糖DMEM完全培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中24 h，收集浸提液，備用。將第3代hADSCs接種于96孔板中培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)基，分別添加100μL低糖DMEM完全培養(yǎng)基（對照組）和100μL PLLA-PCL浸提液（實驗組），繼續(xù)培養(yǎng)。于第1、3、7天，每組各取6個孔。每孔加入10μL CCK-8溶液，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)2 h。然后酶標(biāo)儀測定450 nm波長時的A值，計算相對增殖率并進(jìn)行毒性分級。

1.2.4 hADSCs種植于PLLA/PCL支架

消毒后備用的PLLA/PCL支架用PBS沖洗后，加入低糖DMEM完全培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)過夜。將上清及材料表面的培養(yǎng)基吸凈，選取生長較好的第3代hADSCs，制成密度為1×107cells/m L的細(xì)胞懸液，每個材料表面均勻滴加200μL細(xì)胞懸液，靜置2 h后加入低糖DMEM完全培養(yǎng)基，并置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d換液一次；用于體內(nèi)試驗的細(xì)胞材料復(fù)合物預(yù)先在體外培養(yǎng)3 h再植入裸鼠皮下，并植入單純支架材料作為對照。

1.2.5 組織學(xué)觀察

體外培養(yǎng)的細(xì)胞-支架復(fù)合物培養(yǎng)1周后取材。體內(nèi)培養(yǎng)的材料1周、2周后取材。4%多聚甲醛固定6 h，30%蔗糖脫水過夜，OCT包埋，冰凍切片（8μm厚），HE染色。光鏡下觀察細(xì)胞在支架內(nèi)的生長情況。

1.2.6 體內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞-支架復(fù)合物免疫熒光檢測

體內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞-支架復(fù)合物于2周后取材，冰凍切片。將切片浸水10 h，洗去OCT，檸檬酸微波法修復(fù)抗原，自然冷卻，用0.3%的Triton破膜15 min，滴加羊血清封閉非特異性抗原，一抗為兔抗人SMA抗體，4℃過夜，二抗為帶有紅色熒光標(biāo)記的羊抗兔抗體，DAPI染細(xì)胞核，熒光封片，避光保存。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

SPSS17.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hADSCs的形態(tài)和生長特性

經(jīng)膠原酶消化后的原代細(xì)胞培養(yǎng)96 h后，已有部分成纖維細(xì)胞樣形態(tài)的細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)液上層可見懸浮的紅細(xì)胞和脂滴。貼壁細(xì)胞多呈長梭形，可見少量三角形及多邊形細(xì)胞（圖1A）。隨培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞轉(zhuǎn)為梭形。培養(yǎng)5~7 d細(xì)胞可達(dá)80%~90%融合。傳代的細(xì)胞主要為梭形，少數(shù)為三角形或多邊形（圖1B）。我們的前期研究表明[9]，該方法分離的細(xì)胞可成骨、成脂誘導(dǎo)。流式細(xì)胞鑒定發(fā)現(xiàn)：CD29表達(dá)為99.77%，CD44表達(dá)為97.1%，CD73表達(dá)為96.54%，CD105表達(dá)為93.06%，CD45表達(dá)為0.37%，CD34表達(dá)為1.38%，提示分離得到的細(xì)胞是hADSCs。

圖1 hADSCs形態(tài)學(xué)觀察（40×）Fig.1 Morphological observation of hADSCs(40×)

2.2 支架材料的制備

制備的PLLA-PCL多孔支架外觀呈白色（圖2A），孔徑為40μm左右，但大小不一（圖2B），孔隙率為91.45%左右，與理論值（約90%）相似。

圖2 PLLA/PCL支架材料大體觀及掃描電鏡觀察Fig.2 Gross observation and SEMobservation of PLLA/PCL

2.3 hADSCs在PLLA/PCL浸提液中增殖率的測定

第1、3、7天實驗組相對增殖率分別為98.1%、100.7%和108.4%，平均相對增殖率為102.4%，與對照組無顯著差異（P>0.05），說明浸提液對細(xì)胞增殖無明顯影響。浸提液在第1、3、7天的細(xì)胞毒性分別為I級、0級和0級，說明PLLA/PCL浸提液無細(xì)胞毒性。

2.4 細(xì)胞在支架上的生長情況

hADSCs種植在PLLA/PCL支架后，經(jīng)過體外、內(nèi)培養(yǎng)，hADSCs均能黏附在支架的邊緣，部分細(xì)胞滲透入支架，但支架內(nèi)部長入細(xì)胞較少。其中體外培養(yǎng)1周，已有細(xì)胞貼附在材料邊緣生長，少量細(xì)胞滲透入支架內(nèi)部淺層。體內(nèi)培養(yǎng)1周，細(xì)胞黏附生長在PLLA/PCL支架的邊緣，且已有部分滲透到材料內(nèi)部。體內(nèi)培養(yǎng)2周后，較多細(xì)胞能滲透到材料內(nèi)部。且體內(nèi)培養(yǎng)比體外培養(yǎng)有更多的細(xì)胞長入支架；經(jīng)體內(nèi)培養(yǎng)后，復(fù)合種子細(xì)胞的支架比單純支架有更多的細(xì)胞滲入支架內(nèi)部，且細(xì)胞-材料復(fù)合支架體內(nèi)培養(yǎng)2周后，免疫熒光a-SMA抗體檢測發(fā)現(xiàn)，材料內(nèi)部部分細(xì)胞陽性表達(dá)（圖3）。

圖3 細(xì)胞材料復(fù)合物形態(tài)學(xué)觀察（200×）和免疫熒光檢測（a-SMA，200×）Fig.3 Morphological observation(200×)and immunofluorescence assay(a-SMA,200×)of PLLA-PCL scaffold compound with hA D SCs

3 討論

組織工程膀胱缺損的修復(fù)主要涉及平滑肌細(xì)胞（Smooth muscle cell，SMC）和尿路上皮細(xì)胞（Urothelial cell，UC）。ADSCs通過誘導(dǎo)可向SMC分化，表達(dá)平滑肌特異性的標(biāo)志物，并具備收縮和舒張功能，可用于修復(fù)膀胱肌層缺損[10-13]。近期發(fā)現(xiàn)ADSCs還能向UC表型分化[9,14-15]。脂肪組織還具有來源豐富、取材方便、損傷小等優(yōu)勢，已成為理想的種子細(xì)胞來源。

支架材料是組織工程膀胱修復(fù)重建的重要基礎(chǔ)。理想的膀胱修復(fù)材料應(yīng)具有良好的生物相容性，可靠的機(jī)械性能，能抵抗腹膜內(nèi)及腹膜外感染，不影響正常腎功能，具有良好的收縮能力，并通過神經(jīng)和膀胱平滑肌再生后具有自主排尿功能等[16]。單一成分材料難以滿足膀胱修復(fù)重建的需求[10，17-19]。研究表明，人工合成高分子聚合材料可制備成不同形狀與結(jié)構(gòu)的三維支架，并精確地控制其機(jī)械性能、降解率、孔隙率和孔徑。PLLA分子鏈呈剛性，脆性太高，降解速度快；而PCL具有良好的生物降解性和柔韌性，本實驗聯(lián)合兩者優(yōu)勢性能，制備成PLLA/PCL復(fù)合支架，并復(fù)合hADSCs，探討其細(xì)胞相容性。

本實驗將hADSCs在PLLA/PCL浸提液中培養(yǎng)1、3、7 d，各時間點實驗組和對照組細(xì)胞相對增殖率無顯著性差異（P>0.05）。說明PLLA/PCL浸提液無明顯的細(xì)胞毒性。hADSCs種植于PLLA/PCL支架，經(jīng)體內(nèi)、外培養(yǎng)后，均能長入PLLA/PCL支架孔隙內(nèi)，表明PLLA/PCL具有良好的細(xì)胞親和性，PLLA用PCL修飾后，其疏水性能改善明顯，有利于細(xì)胞的黏附生長。實驗結(jié)果表明體內(nèi)培養(yǎng)比體外培養(yǎng)有更多的細(xì)胞長入支架內(nèi)部，可能是由于體內(nèi)環(huán)境為細(xì)胞生長提供了豐富的血供和營養(yǎng)，更利于細(xì)胞的黏附、增殖。而經(jīng)體內(nèi)培養(yǎng)后，復(fù)合種子細(xì)胞的支架比單純支架有更多的細(xì)胞滲入支架內(nèi)部，可能是hADSCs在體內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)增的結(jié)果，亦或是hADSCs分泌的細(xì)胞因子，促進(jìn)了裸鼠細(xì)胞向支架內(nèi)部生長，其中可能涉及自分泌和旁分泌的機(jī)制[20-22]。SMA抗體檢測發(fā)現(xiàn)，支架材料內(nèi)部分細(xì)胞陽性表達(dá)，說明PLLA/PCL支架內(nèi)部分細(xì)胞來源于hADSCs。我們前期分別用豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)（Bladder acellular matrix graft，BAMG）和人工合成材料聚羥基乙酸（Polyglycolic acid，PGA）作為支架材料用于組織工程膀胱修復(fù)[23-24]。發(fā)現(xiàn)BAMG雖然材料致密，細(xì)胞滲透材料內(nèi)部較少，但具有多種活性因子，生物相容性較好，可促進(jìn)細(xì)胞黏附，有利于組織修復(fù)，在體外成功進(jìn)行了膀胱平滑肌結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。PGA生物相容性及可塑性良好，作為支架材料并復(fù)合膀胱平滑肌細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞，可體外構(gòu)建類似復(fù)層膀胱壁結(jié)構(gòu)。而盡管PLLA/PCL復(fù)合材料具有多孔結(jié)構(gòu)，但細(xì)胞長入支架內(nèi)部尤其是中心區(qū)域較少，和上述復(fù)合材料相比，該復(fù)合材料的滲透性仍需改進(jìn)[l4]。

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Biocompatibility on Human Adipose-Derived Stem Cells Co-cultured with Poly-L-lactide/Polycaprolactone Scaffold

YAO Haijun1,ZHAO Yang1,ZHOU Zhe1,XIAO Dongdong1,ZHOU Juan1,ZHANG Ming1,WANG Zhong1,HE Chuanglong2, LU Mujun1.1 Department of Urology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200011,China;2 College of Chemistry,Chemical Engineering and Biotechnology,Donghua University,Shanghai 200051,China.Corresponding author:LU Mujun(E-mail:lumujun@163.com).

ObjectiveTo observe the growth of human adipose-derived stem cells(hA D SCs)on Poly-L-lactide/ Polycaprolactone composite scaffold materials and the biological compatibility.MethodshASCs were isolated from human subcutaneous adipose tissue and PLLA/PCL scaffold was prepared.The cytotoxicity of scaffold was evaluated by CCK-8 cell viability assay.The P3 hASCs were seeded onto the PLLA/PCL scaffolds.The growth of cell in PLLA/PCL biomaterials in vivo(1 w and 2 w)and in vitro(1 w)was observed by HE staining.The expression of SMA of the seeding cells in vivo was detected by immunofluorescence.ResultshA D SCs maintained high proliferation rate in the leaching solution of the PLLA/ PCL and the PLLA/PCL scaffolds were nontoxic absolutely.The histological study found that hA D SCs could grow into the space of the PLLA/PCL scaffolds after cultured in vitro and in vivo.There were more cells in the scaffolds cultured in vivo than in vitro,also more cells in the cell-seeded scaffold than simple scaffold.Some of the seeding cells were positive for SMA after 2 weeks implanted in the scaffold in vivo.ConclusionPLLA-PCL composite scaffolds are nontoxic and have a good biocompatibility with hA D SCs,which can be used as a vehicle for hA D SCs in the repair of bladder defect.

Human adipose-derived stem cells;Poly-L-lactide;Polycaprolactone;Biocompatibility

Q813.1+1

A

1673－0364（2014）05－0255－04

2014年4月21日；修復(fù)日期：2014年6月12日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2014.05.005

國家自然科學(xué)基金面上項目（81370860，81070605）；上海交通大學(xué)“醫(yī)工（理）交叉研究基金”（YG2011MS14）。

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院泌尿外科（姚海軍，趙陽，周哲，肖冬冬，周娟，張明，王忠，盧慕峻）；200051上海市東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院（何創(chuàng)龍）。

盧慕峻（E-mail：lumujun@163.com）。

注：姚海軍，趙陽為共同第一作者。