小鼠骨髓細胞染色體G帶制片技術(shù)的探討

盧洪武， 黎杰強， 鄧優(yōu)美

(華南師范大學 生命科學學院,廣東 廣州 510631)

0 引 言

越來越多的研究表明，一個物種的染色體組型在很大程度上具有物種的特異性，并能在胞水平上反映物種的分化和形成過程、親緣關(guān)系、演化途徑和進化歷史。在對染色體的研究過程中，細胞學家期望通過實驗技術(shù)，導致染色體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的分化染色，以獲得更多的具有鑒別特征的信息，即所謂染色體的“解剖學”特征?？茖W家用各種不同的方法，以及用不同的染料處理染色體標本后，使每條染色體上出現(xiàn)明暗相間,或深淺不同帶紋，這種分化染色技術(shù)即為染色體顯帶技術(shù)[1]。這些顯帶圖型在發(fā)育過程中以及不同組織的細胞間是恒定的[2]。G帶是目前被廣泛應(yīng)用的一種帶型。因為它主要是被姬姆薩(Giemsa)染料染色后而顯帶,故稱之為G顯帶技術(shù)(G-band exhibition)，其所顯示的帶紋分布在整個中期細胞的染色體上。

G帶技術(shù)是由Pardue等建立，方法是先用加熱或蛋白水解酶處理未染色的中期染色體玻片，然后用Giemsa染料染色，結(jié)果染色體呈現(xiàn)清晰、特異的G帶。據(jù)認為G 顯帶技術(shù)中，DNA 和蛋白質(zhì)均與染料的麥硫因和伊紅成分作用，G 陽性帶為富含AT 的DNA區(qū)。由于每條染色體都有其較為恒定的帶紋特征，經(jīng)分帶技術(shù)處理后，在染色體上所呈現(xiàn)的帶紋反映了染色體的固有結(jié)構(gòu)，可顯示不同物種染色體的差異或同一物種不同染色體的差異，進而較為準確地識別每條染色體，并可發(fā)現(xiàn)染色體上較細微的結(jié)構(gòu)畸變[3]。顯帶技術(shù)不僅解決了染色體的識別問題，由于染色體上能區(qū)別許多區(qū)和帶，還為深入研究染色體的異常和基因定位創(chuàng)造了條件，這對染色體結(jié)構(gòu)與功能的研究、染色體畸變及其機制的研究、癌變藥物作用機理等研究都有重要意義[2]。小鼠是生物醫(yī)學研究中使用數(shù)量最多的哺乳類實驗動物，遺傳組成與人類非常相似，這為建立哺乳類動物研究模型提供了有力的依據(jù)。更重要的是小鼠遺傳資源豐富，已經(jīng)成功培育478個近交系，通過自發(fā)突變、誘發(fā)突變和轉(zhuǎn)基因技術(shù)等途徑培育并保存了2 000多個突變品系[4]。

目前，獲得G帶的途徑只要有兩類技術(shù):一類是在濃鹽溶液中進行熱處理;另一類是用蛋白水解酶消化。后者因操作簡易得到廣泛應(yīng)用。從當前研究狀況看，大部分動物的染色體都能顯示G帶，但針對不同的物種，或同一物種的不同品種，要獲得良好的G帶，其制片處理方法不盡相同。在王俊森等[5-8]對東北鼢鼠、小鼠骨髓細胞、廣東白腹巨鼠、近交系豫醫(yī)無毛小鼠的G帶帶型分析中，染色體顯帶處理的實驗條件會有較大的差異，這說明G帶技術(shù)與研究的材料、藥品等密切相關(guān)。小鼠染色體數(shù)目多，且染色體小，要制作出好的染色體G帶玻片標本有一定難度。本文主要探討小鼠骨髓細胞染色體玻片標本制片技術(shù)及G帶技術(shù)，為小鼠的物種與結(jié)構(gòu)功能研究提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

0.1%秋水仙素溶液，2%檸檬酸鈉溶液，0.075 mol/L氯化鉀溶液，固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1,臨用時現(xiàn)配)，Giemsa原液，胰蛋白酶(美國Life Technologies公司)，磷酸緩沖液(PBS)，pH 7.0 GKN液，pH 7.0 ICN液，25 g左右的小白鼠(雌雄均可)。

1.2 方 法

1.2.1低滲法制備染色體標本

小白鼠腹腔注射秋水仙素溶液(3～4 μg/g體重)，3～4 h后取出兩側(cè)股骨、脛骨,將骨髓沖于2%檸檬酸鈉溶液中，用吸管打散細胞團，使骨髓細胞懸浮于檸檬酸鈉溶液中，經(jīng)1 500 r/min離心10 min后棄上清液，加入KCl液5 mL，用吸管吹散均勻后于37 ℃恒溫水浴鍋低滲20～30 min，1 500 r/min離心10 min后棄上清液，加固定液5 mL，靜置10 min，1 500 r/min離心10 min，重復上一固定、離心步驟，棄上清液保留約0.5 mL固定液制成細胞懸液，于預(yù)冷載玻片上滴片(滴片高度約15 cm，滴面不重復)[9]。使用電吹風吹干后，轉(zhuǎn)入37 ℃培養(yǎng)箱中備用。

1.2.2G帶制片

小白鼠染色體標本片保存時間不超過30 d，處理前將制片放于60 ℃烤箱中加熱30 min，或在酒精燈上微微加熱后分別浸入用ICN液配置的0.025%、0.05%、0.125%、0.25%不同濃度的胰蛋白酶中，處理時間如表1設(shè)置，一定時間后取出玻片，立即放入GKN液中漂洗2次。吹干染色體標本，用37 ℃預(yù)熱的Giemsa染液(原液1份，pH 6.8的PBS 19份)染色5～10 min。蒸餾水清洗晾干后鏡檢。

表1 染色體標本胰蛋白酶處理時間

1.2.3觀察

在低倍鏡下觀察，選擇染色體分散良好、無重疊的分散中期的細胞，記錄好細胞所在玻片位置的坐標；胰蛋白酶處理后根據(jù)已記錄的細胞坐標，轉(zhuǎn)至高倍鏡下仔細辨析，觀察染色體形態(tài)及G帶帶紋，并拍片記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 胰蛋白酶濃度、消化時間與G帶的關(guān)系

不同胰蛋白酶處理濃度及處理時間，G帶顯示效果有較大的差異，顯帶效果如表2所示。它們之間并不呈一種簡單的隨濃度或時間遞增或遞減的線性關(guān)系，變化較復雜。

表2 不同胰蛋白酶濃度及處理時間染色體的顯帶效果

2.1.10.025%胰蛋白酶處理染色體的顯帶效果

用0.025%胰蛋白酶處理染色體標本，60 s消化時間，染色體未顯G帶(見圖1(a))，120 s的消化時間，結(jié)果顯示染色體仍未顯示G帶紋(見圖1(b))。雖然目前對染色體顯帶的原理還不清楚，但一般認為蛋白質(zhì)的不均一丟失是產(chǎn)生G帶的主要原因[10]。在胰蛋白酶的作用下，染色體某些區(qū)域水解脫落，抽掉一定數(shù)量的蛋白質(zhì)后顯示出淺帶；而蛋白質(zhì)丟失少并與DNA牢固結(jié)合的區(qū)域則染為深帶。據(jù)此，染色體未顯示帶紋可能是因為胰蛋白酶的濃度太低，不能充分、有效地消化染色體上的蛋白質(zhì)，故不能出現(xiàn)明暗相間的橫紋。

(a)60s(b)120s

圖1 0.025%胰蛋白酶處理效果(×400)

2.1.20.05%胰蛋白酶處理染色體的顯帶效果

用0.05%胰蛋白酶處理染色體標本(見表2)，在60 s內(nèi)的消化時間中,處理時間小于20 s，未見G帶顯示(見圖2(a))，而處理時間30 s或大于30 s，染色體輪廓均表現(xiàn)出發(fā)毛現(xiàn)象(邊緣模糊不清)、帶紋模糊,即酶處理過度(見圖2(b))，推測合適處理時間在20～30 s。

(a)20s(b)30s

圖2 0.05%胰蛋白酶處理效果(×1 000)

用0.05%胰蛋白酶按1s的梯度進一步探究20～28 s內(nèi)染色體的顯帶效果(見表3)。在21～23 s的消化時間，G帶紋從無到有。處理玻片標本21 s，染色體不能顯示任何帶紋(見圖3(a))；處理玻片標本22 s，僅有部分染色體顯示G帶紋(見圖3(b))；處理玻片標本23 s，染色體出現(xiàn)了較多的G帶紋(見圖3(c))。

表3 0.05%濃度胰蛋白酶不同處理時間染色體的顯帶效果

(a)21s(b)22s(c)23s

圖3 0.05%胰蛋白酶處理效果(×1 000)

用0.05%胰蛋白酶處理染色體標本，在24～26 s的消化時間中，染色體經(jīng)胰蛋白酶處理后均能顯示清晰的帶紋，即出現(xiàn)明暗相間的G帶(見圖4)，并且3個消化時間段的顯帶效果相近，說明在24～26 s這個消化時間內(nèi)，對小鼠染色體G帶的顯示最合適。而21、22 s消化時間未能充分顯示G帶，23 s消化時間能顯示較多的G帶，但清淅度稍低。說明在適宜胰蛋白酶濃度下G帶顯示主要受處理時間的影響。

(a)24s(b)25s(c)26s

圖4 0.05%胰蛋白酶處理染色體帶紋清晰(×1 000)

玻片標本染色體酶處理前染色均一、形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰(見圖5(a)，圖6(a))，用0.05%胰蛋白酶處理染色體標本27 s，染色體顯示G帶紋(少)，染色體染色變淺，即開始出現(xiàn)消化過度的現(xiàn)象(見圖5(b))。用胰蛋白酶消化染色體標本28 s，染色體顯示G帶紋(少)，染色體邊緣發(fā)毛、輪廓模糊(見圖6(b))，說明胰蛋白酶處理過度的程度加強。增加消化時間，G帶紋會變模糊，染色體也變模糊至完全被酶消化而消失。

圖5(a) 胰蛋白酶處理前(CK)(×400)圖5(b) 0．05%胰蛋白酶處理27s(×1000)圖6(a) 胰蛋白酶處理前(CK)(×400)圖6(b) 0．05%胰蛋白酶處理28s(×1000)

2.1.30.125%、0.25%胰蛋白酶染色體顯帶效果

用0.125%、0.25%胰蛋白酶，按5，10，20，30，40，50，60 s處理玻片標本，結(jié)果表明：所有處理時間，染色體均表現(xiàn)酶處理過度，未顯示G帶(見表2)，具體表現(xiàn)染色體模糊、輪郭不清、色淡、移位或脫落(見圖7)。原因是胰蛋白酶濃度過高，在短時間內(nèi)將染色體上的蛋白質(zhì)大部分消化的結(jié)果。

圖7 0.125%胰蛋白酶處理5 s(×1 000)

2.2 預(yù)處理對G帶分帶的影響

預(yù)處理是用秋水仙素于處死小鼠前3～4 h對小鼠骨髓細胞進行中期阻斷，原理是秋水仙素可以抑制微管的聚合從而抑制紡錘體的形成，將細胞阻斷在有絲分裂中期，從而增加處于分裂中期的染色體的細胞數(shù)[11]。此外，秋水仙素對染色體有收縮作用，染色體適當收縮使自身形態(tài)清晰，染色體著絲點更明顯[12]。

實驗中曾嘗試加大秋水仙素的預(yù)期用量，結(jié)果鏡檢發(fā)現(xiàn),絕大部分染色體都呈收縮狀態(tài)，部分染色體甚至縮成點狀或棒狀。由于細胞周期的時間是相對恒定的，秋水仙素用量過大或處理時間過長不僅不會使中期分裂相數(shù)目增加，還有可能導致染色體的過分凝縮或著絲點裂解，最終會引起染色體形態(tài)不正常，甚至被破壞或溶解[11]。經(jīng)試驗用0.1%秋水仙素以4 μg/g的體重比例經(jīng)腹腔注射，藥物作用3 h的效果最好，制作出的骨髓細胞染色體標本則能獲得更多的中期細胞，并且染色體長度適中，二條單體明顯，形態(tài)清晰。

用胰蛋白酶最佳濃度(0.025%)和最佳時間(25 s)處理小鼠兩種形態(tài)的染色體：① 預(yù)處理過度的染色體(見圖8(a))，處理后不能清晰顯示G帶紋或顯示的條數(shù)太少(見圖8(b))；② 預(yù)處理合適的染色體體制片(見圖9(a))，經(jīng)胰蛋白酶處理25 s后可清晰顯示G帶紋，G帶數(shù)目多(見圖9(b))。

2.3 低滲對G帶分帶的影響

低滲使細胞膨脹，利于染色體分散。低滲過度，如低滲時間長或低滲溫度高會使細胞提前破裂(滴片前)，制片后則易造成染色體過度分散，不利于判斷某些染色體屬于哪個細胞；低滲不足，如低滲時間不足或低滲溫度過低則會造成細胞吸脹不足，滴片后細胞膜不能破裂，染色體無法散開。有研究發(fā)現(xiàn)：低滲能導致染色體某些結(jié)構(gòu)上的不均一性，有助于顯帶[13]。因此低滲也是控制染色體標本質(zhì)量的重要步驟，實驗中需要控制好低滲時間與溫度。實驗發(fā)現(xiàn)：將細胞材料用預(yù)熱至37 ℃,0.075 mol/ L氯化鉀低滲液中處理25 min，能使骨髓細胞膨脹得更好，滴片時染色體更分散，酶處理后帶紋顯示更清晰。

圖8(a) 高度濃縮的染色體(胰蛋白酶處理前)(×400)圖8(b) 高度濃縮的染色體經(jīng)0．05%濃度胰蛋白酶處理25s(×1000)圖9(a) 預(yù)處理合適的染色體(胰蛋白酶處理前)(×400)圖9(b) 預(yù)處理合適的染色體經(jīng)0．05%濃度胰蛋白酶處理25s(×1000)

3 討 論

由于G帶顯示技術(shù)具有操作簡單、帶紋清晰、周期較短等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于遺傳研究中。但該技術(shù)受多種因素影響，要獲得良好的G帶制片亦有較大的難度。本實驗的研究表明：骨髓細胞染色體G帶顯示標本的制作，主要受胰蛋白酶濃度及消化時間,也受秋水仙素預(yù)處理濃度時間,低滲等因素的影響。

3.1 胰蛋白酶濃度及消化時間是影響小白鼠染色體G帶制片的關(guān)鍵因素

在實驗中選用0.025%、0.05%、0.125%、0.25%不同濃度的胰蛋白酶液進行不同消化時間的處理，其中0.05%的胰蛋白酶液在37 ℃下消化24～26 s效果最好，能顯示出清晰的帶紋(圖4)；而在0.025%胰蛋白酶液、長達120 s的消化時間下，染色體仍未顯示G帶帶紋；在0.125%、0.25%胰蛋白酶液、低至5 s的消化時間下，染色體均顯示出酶處理過度的現(xiàn)象(圖7)。因此，胰蛋白酶液濃度過低或過高、消化時間過短或過長都會影響帶紋的顯示，消化不足帶紋不出現(xiàn)，消化過度染色體受破壞，因此必須把握好胰酶處理濃度和消化時間。當然小鼠染色體G帶并不呈一種簡單的隨濃度或時間遞增或遞減的線性關(guān)系，只在合適的濃度才會與處理時間成線性關(guān)系。當然，酶本身的活力大小也是影響酶處理的濃度和時間的關(guān)鍵因素，其次實驗材料及實驗條件不同，也會影響實驗的結(jié)果，這是不同的研究者在染色體分帶技術(shù)酶處理上的差異所在[14-15]。

3.2 制片效果對分帶的影響

制片質(zhì)量對分帶的效果有決定性的影響。實驗分帶的制作首先要求玻片上存在大量骨髓細胞，且細胞分布均勻，其次中期分裂相多，最后中期染色體形態(tài)清晰，長度適中，無重疊，扭曲或變形。

取材不足或在實驗操作過程中造成材料丟失過多是引起細胞數(shù)量不足的直接原因，而獲得足夠數(shù)量的細胞是獲得更多分裂相的保證。為了盡可能多地獲得中期細胞，首先每次實驗以2只小鼠為宜，并且用低滲液反復沖洗骨髓腔直至發(fā)白為止；其次造成細胞及中期分裂相較少的另外一個原因和低滲后的離心、吹打過程有關(guān)，經(jīng)過低滲的細胞變得膨脹易破，離心、吹打都必須小心。此時離心的轉(zhuǎn)速不能太高，如轉(zhuǎn)速過高則使細胞在此時破裂而丟失[16]。為了收集到足夠的細胞同時又能保證低滲后的細胞最大限度保證完整性，選用1 500 r/min離心10 min為宜。另外在離心后細胞的懸浮、制片時細胞懸液的濃度和染色完畢后的沖洗都對制片質(zhì)量有影響[17]。

中期分裂相的數(shù)目還與小鼠的身體狀況有關(guān),有研究指出腹腔注射淀粉肉湯、背部剪皮及斷尾損傷三種方法都能增加骨髓細胞中期分裂相[18]。實驗中嘗試對小鼠進行斷尾處理，原理是小鼠背部剪皮及斷尾都屬機械性損傷，損傷部位會有血漿液和白細胞(主要是中性粒細胞及單核細胞)滲出，也會加速骨髓粒細胞及單核細胞的分裂增殖。即該方法對部分骨髓細胞增殖起到了正調(diào)控作用，即加速了部分骨髓細胞的分裂增殖，使有絲分裂指數(shù)升高。

玻片預(yù)冷不足或有油污，則不利于染色體及細胞在玻片上分散開，染色體易聚集、重疊，為了避免影響，實驗中采用干凈的玻片，預(yù)冷處理的玻片以水面剛剛結(jié)冰為宜。滴片過程中一度認為離玻片越高越有利于細胞及染色體的分散，事實上滴片高度過高，容易造成細胞聚集成圓狀，大量的細胞堆積在一起，不利于染色體的觀察，滴片時最佳高度約為15 cm；另外滴片時每張玻片上的懸液最好控制在1滴，一張玻片重復滴片容易造成不同細胞內(nèi)的染色體重疊。滴片后應(yīng)注意立即把玻片上的懸液吹散，使其盡可能在玻片上鋪展開。

3.3 染色劑對分帶效果的影響

在染色體觀察時往往會發(fā)現(xiàn)染色體呈藍色，而不是易于觀察的玫瑰紅色。分析其與染液的配制及染色時間有關(guān)，實驗中采用Giemsa染液對染色體染色，其濃度過高或染色時間過長會使染色體著色過深，不利于對裂隙、斷裂的檢出，因此染色時染液濃度要適中，染色時間不能太長。另外實驗中所用到的Giemsa 染液是先由Giemsa 干粉研磨制成母液再稀釋進行染色，由于研磨不徹底、干粉本身不純等原因，有可能會在玻片中帶入雜質(zhì)，嚴重干擾染色體的染色效果。經(jīng)實驗探索發(fā)現(xiàn)用45%冰醋酸去色后復染或染色前對Giemsa 染液過濾可有效改善染色效果，這與Hutchison等[19-20]研究發(fā)現(xiàn)：冰醋酸還能使DNA 脫尿環(huán)，產(chǎn)生缺口或抽掉組蛋白( 特別是組蛋白H1)，利于顯帶的結(jié)論相符。因此實驗中可利用稀釋的冰醋酸去色后復染以獲得更好的染色效果，另外也對G帶顯帶起到一定的作用。

4 結(jié) 語

骨髓染色體制備技術(shù)是細胞遺傳學及細胞生物學的核心基本技術(shù)之一，通過熟悉實驗中所出現(xiàn)的各種問題并掌握正確的解決對策，探索出一種成熟的染色體G帶制片技術(shù)對日后進一步提高分辨率或者說增加帶紋的數(shù)目和清晰度，對比度，最終達到多線染色體的水平的目標[21]具有重大的意義。

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