張亞洲,樊蘭蘭,覃山丁,李典鵬(.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園天然藥物化學(xué)中心,南寧 530023;2.廣西壯族自治區(qū)/中國科學(xué)院桂林植物研究所,廣西桂林 54006)
瑤藥天鉆的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ
張亞洲1,2*,樊蘭蘭1,覃山丁1,李典鵬2#(1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園天然藥物化學(xué)中心,南寧 530023;2.廣西壯族自治區(qū)/中國科學(xué)院桂林植物研究所,廣西桂林 541006)
目的:建立瑤藥天鉆藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法:分別對(duì)天鉆藥材進(jìn)行顯微鑒別和薄層色譜(TLC)鑒別;按照《中國藥典》方法進(jìn)行水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物檢查;采用高效液相色譜法測(cè)定藥材中馬兜鈴酸的含量:色譜柱為Phenomenex Gem iniC18(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相為乙腈-水(含0.34%三乙胺、0.94%乙酸,梯度洗脫),檢測(cè)波長為260 nm。結(jié)果:天鉆藥材的顯微特征明顯;TLC圖中能清晰顯現(xiàn)與馬兜鈴酸A對(duì)應(yīng)的點(diǎn);馬兜鈴酸A的質(zhì)量濃度在1.703~109.000μg/m l范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9),平均加樣回收率分別為97.54%、101.16%、101.15%,RSD分別為0.22%、0.63%、0.39%(n=3)。結(jié)論:所建標(biāo)準(zhǔn)可用于天鉆藥材的質(zhì)量控制。產(chǎn)自廣西、云南的11批天鉆藥材在顯微、外觀等方面質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定,但馬兜鈴酸A的含量差異較大。
天鉆;馬兜鈴酸A;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);瑤藥
*助理研究員,博士。研究方向:天然藥物的活性成分和代謝。E-mail:yazhou_zhang2009@163.com
#通信作者:研究員,碩士研究生導(dǎo)師,博士。研究方向:藥物資源功能物質(zhì)開發(fā)。E-mail:ldp@gxib.cn
瑤藥天鉆是馬兜鈴科馬兜鈴屬植物廣西馬兜鈴Aristolochia kwangsiensisChun etHow ex C.F.Liang的塊根[1],別名金銀袋、大總管、蘿卜防己、大青木香,原植物主要分布于浙江、福建、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南等地的山谷林中[1-3]。文獻(xiàn)研究顯示,從天鉆中分離出了尿囊素、馬兜鈴酸、β-谷甾醇、6-甲氧基去硝基馬兜鈴酸甲酯、6-甲氧基馬兜鈴酸A甲酯及木蘭花堿[2-3]。藥理研究發(fā)現(xiàn):(1)其總生物堿具有解痙、鎮(zhèn)痛作用[3-4];(2)馬兜鈴酸主要有抗腫瘤、致突變與腎臟毒性作用[2-5];(3)天鉆提取物對(duì)臨床各種疾患所致平滑肌痙攣性腹痛的止痛效果較好[6]。目前,天鉆常作為抗腫瘤、止痛藥物使用,但是其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未見研究報(bào)道。鑒于此,筆者對(duì)天鉆藥材中可引起腎毒性的成分馬兜鈴酸A的薄層色譜(TLC)鑒別方法和高效液相色譜(HPLC)含量測(cè)定方法進(jìn)行了研究,制定了其含量限度,并完成了其他檢查項(xiàng)目,以期科學(xué)、有效地控制藥材質(zhì)量,保證其臨床療效和安全性。
1200型HPLC儀,含紫外檢測(cè)器等(美國Agilent公司);HD-1024A型超聲儀(寧波市恒大超聲設(shè)備有限公司,功率:1 200 W,頻率:25~28 kHz)。
馬兜鈴酸A對(duì)照品(筆者自制,經(jīng)HPLC法測(cè)定純度>98%);硅膠G(青島海洋化工廠);乙腈為色譜純,其他試劑均為分析純。
天鉆藥材共11批(樣品信息見表1),均經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院方鼎研究員鑒定其來源為廣西馬兜鈴。完成樣品收集后,將所有11批樣品(約100 g)進(jìn)行粉碎處理,并統(tǒng)一過40目篩,備用。
表1 天鉆藥材樣品信息Tab 1 Information of A.kwangsiensis sam p le
2.1.1性狀鑒別 天鉆塊根肥大,呈紡錘形,長30~60 cm。表面棕褐色,有時(shí)有須根或須根痕。質(zhì)堅(jiān)而硬,斷面類白色,木部寬廣,淡黃或白色,氣微香特異,味苦。
2.1.2 顯微鑒別 ①塊根橫切面:木栓層由10余列長方形細(xì)胞組成,栓化并木化,皮層中有單個(gè)或數(shù)個(gè)成群散在的石細(xì)胞;韌皮部寬廣,韌皮部薄壁細(xì)胞中含有大量的淀粉粒,形成層不明顯;木質(zhì)部寬廣,射線寬1~3列細(xì)胞,導(dǎo)管大小不一,多單個(gè)呈徑向排列。②本品粉末棕色;淀粉粒眾多,類圓形、類球形或不規(guī)則,單?;驈?fù)粒,復(fù)粒由2~8個(gè)單粒組成,單粒直徑為6~36μm,層紋明顯;石細(xì)胞眾多,類方形或多角形,黃色,單個(gè)散在或多個(gè)成群,孔溝明顯,直徑20~60μm;草酸鈣簇晶常見,直徑5~12μm;木栓細(xì)胞類方形,內(nèi)含棕色物,直徑8~15μm;具緣紋孔導(dǎo)管多破碎,直徑20~40μm;纖維束偶見,長40~200μm。
顯微鑒別要點(diǎn):淀粉粒眾多,黃色石細(xì)胞孔溝明顯,單個(gè)或聚集成群,可見草酸鈣簇晶,這是其顯微鑒別的主要特征。顯微鑒別圖見圖1、圖2。
圖1 天鉆塊根橫切面的顯微全貌圖1.木栓層;2.石細(xì)胞;3.韌皮部;4.淀粉粒;5.形成層;6.木質(zhì)部;7.木射線;8.髓Fig 1 M icrograph of the transaction of the roots of A.kwangsiensis1.phellem layer;2.lithocyte;3.phloem;4.starch grain;5.cambium layer;6.xylem;7.xylem rays;8.pith
圖2 天鉆粉末的顯微鑒別圖Fig 2 M icrograph of the powder of A.kwangsiensis
2.1.3 TLC鑒別 取本品粉末0.5 g,加石油醚(60~90Ⅱ)50 m l,超聲提取30min,濾過,殘?jiān)蛹状?0m l,再超聲提取30 min,濾過,濾液濃縮至干,用甲醇2m l使溶解,作為供試品溶液。另取馬兜鈴酸A對(duì)照品,加甲醇制成每1m l含2mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照TLC法[7]試驗(yàn),吸取上述兩種溶液各2μl,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以環(huán)己烷-乙酸乙酯-乙酸(4∶1∶2滴)飽和8min為展開劑,展開,取出,晾干,置紫外光燈(254 nm)下檢視。結(jié)果顯示,供試品色譜中,在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)。天鉆的TLC圖見圖3。
圖3天鉆的TLC圖S.馬兜鈴酸A對(duì)照品;1~11.天鉆藥材樣品Fig 3 TLC of A.kwangsiensisS.aristolochic acid A control;1-11.A.kwangsiensis samples
2.2.1 水分 照水分測(cè)定法[7]測(cè)定,可得11批樣品的水分含量均在16.0%以下。考慮到該藥材為南方所產(chǎn),而南方氣候較為濕潤,因此將本品水分限度擬定為不得過16.0%。
2.2.2 總灰分 照灰分測(cè)定法[7]測(cè)定,可得11批樣品的總灰分含量均在6.0%以下,故將本品總灰分限度擬定為不得過6.0%。
2.2.3 酸不溶性灰分 照灰分測(cè)定法[7]測(cè)定,可得11批樣品的酸不溶性灰分含量均在2.0%以下,故將本品酸不溶性灰分限度擬定為不得過2.0%。
2.2.4 浸出物 查閱相關(guān)文獻(xiàn)可知,天鉆中的活性成分聚集在乙酸乙酯部位,且該成分為脂溶性成分[2-6]。因此,初步考慮采用醇溶性浸出物來考察天鉆中所含的活性成分;而加熱提取一方面有利于化學(xué)成分的溶出,另一方面又節(jié)省了試驗(yàn)時(shí)間,最終確定采用熱浸法進(jìn)行試驗(yàn)。預(yù)試驗(yàn)還比較了50%乙醇與95%乙醇作為提取溶劑的提取效果,結(jié)果表明,50%乙醇的提取效果較優(yōu)(以TZ-1為供試品,前者浸出物含量為15.36%,后者浸出物含量為11.40%),故最終確定以50%乙醇為提取溶劑。照醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法[6]測(cè)定,可得本品11批浸出物的含量均在8.0%以上,故將本品浸出物含量限度擬定為不少于8.0%。
2.3.1色譜條件 色譜柱:Phenomenex GeminiC18(250mm× 4.6mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-水(含0.34%三乙胺、0.94%乙酸),梯度洗脫(洗脫程序見表2);流速:1m l/min;檢測(cè)波長:260 nm;柱溫:室溫。色譜見圖4。
表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradientelution process
圖4 高效液相色譜圖A.馬兜鈴酸A對(duì)照品;B.天鉆藥材樣品Fig 4 HPLC chromatogram sA.aristolochic acid A control;B.A.kwangsiensis sample
2.3.2線性關(guān)系考察 精密稱取馬兜鈴酸A對(duì)照品21.8mg,置于100m l量瓶中,用甲醇超聲溶解后放至室溫,再用甲醇稀釋至刻度,得溶液①。取溶液①5m l,置于10m l量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,得溶液②。取溶液①25m l,置于100m l量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,得溶液③。取溶液③5m l,置于10m l量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,得溶液④。取溶液④5m l,置于10m l量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,得溶液⑤。取溶液⑤5m l,置于10m l量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,得溶液⑥。取溶液⑥5m l,置于10m l量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,得溶液⑦。取溶液⑦5m l,置于10m l量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,得溶液⑧。取以上②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧溶液各20μl,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。以峰面積積分值(y)為橫坐標(biāo),對(duì)照品質(zhì)量濃度(x)為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為x=0.009 8y+0.050 7(r=0.999 9,n=7)。結(jié)果顯示,馬兜鈴酸A的質(zhì)量濃度在1.703~109.000μg/m l范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。
2.3.3供試品溶液的制備 精密稱取樣品約0.5 g,置于50m l量瓶中,用甲醇超聲30min溶解后放至室溫,再用甲醇稀釋至刻度,搖勻,以0.45μm微孔濾膜濾過,即得。取20μl進(jìn)樣。
2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(編號(hào):TZ-6)0.23 g,平行9份,每3份為一組,分別加入已知樣品中馬兜鈴酸A含量的125%、100%、75%的對(duì)照品,按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算加樣回收率,結(jié)果見表3。
表3 馬兜鈴酸A的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Tab 3 Resultsof recovery testsof aristolochic acid A(n=3)
2.3.5 樣品含量測(cè)定 取各批天鉆藥材粉末約0.5 g,分別按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算樣品中馬兜鈴酸A的含量,結(jié)果見表4。
表4 各批天鉆藥材中馬兜鈴酸A的含量測(cè)定結(jié)果(%,n=3)Tab 4 Results of content determ ination of aristolochic acid A in A.kwangsiensis(%,n=3)
文獻(xiàn)中用于馬兜鈴酸A含量測(cè)定的檢測(cè)波長有387、304、260 nm[7-9],筆者通過對(duì)天鉆藥材的色譜圖進(jìn)行比較后,確定檢測(cè)波長為260 nm。后又對(duì)色譜柱、流動(dòng)相進(jìn)行了篩選,最終確定文中色譜條件,且分離效果較好。
關(guān)于天鉆中化學(xué)成分的研究較少,均完成于20世紀(jì)90年代以前,其有效成分至今尚未明確。本研究中,筆者選擇天鉆中含有腎毒性成分的馬兜鈴酸A作為指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定,目的在于提示在天鉆使用過程中應(yīng)注意用藥的安全性。本研究發(fā)現(xiàn),購買的天鉆藥材中馬兜鈴酸A的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均小于千分之一,這是否因放置時(shí)間太長或是受地域因素的影響,值得進(jìn)一步研究。
綜上所述,所建標(biāo)準(zhǔn)可用于天鉆藥材的質(zhì)量控制。
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Quality Study of Yao M edicineAristolochia kwangsiensis
ZHANG Ya-zhou1,2,F(xiàn)AN Lan-lan1,QIN Shan-ding1,LIDian-peng2(1.Natural Pharmaceutical Chem istry Center,Guangxi Zhuang Autonomous Region Medicinal Botanical Garden,Nanning 530023,China;2.Guangxi Zhuang Autonomous Region Guilin Botany Institute,Chinese Academy of Sciences,GuangxiGuilin 541006,China)
OBJECTIVE:To establish quality control of Yao medicineAristolochia kwangsiensis.METHODS:The samples were identified by m icroscopic identification and TLC;according to the method ofChinese Pharmacopoeia,moisture,total ash,acid-insoluble ash and extract were detected;the content of aristolochic acid was determ ined by HPLC.The separation was performed on Phenomenex Gem ini C18(250 mm×4.6 mm,5μm)column w ith mobile phase consisted of acetonitrile-water(containing 0.34%triethylam ine,0.94%acetic acid,gradient elution)at detection wavelength of 260 nm.RESULTS:M icroscopic characteristics ofA.kwangsiensiswere distinctive;TLC spots were clear;the linear range of aristolochic acid A were 1.703-109.000μg/m l(r=0.999 9)w ith average recoveries of 97.54%(RSD=0.22%,n=3),101.16%(RSD=0.63%,n=3)and 101.15%(RSD=0.39%,n=3).CONCLUSIONS:Established standard can be used for quality control ofA.kwangsiensis.The m icroscopy and appearance of 11 batches ofA.kwangsiensisfrom Guangxi and Yunnan province have kept stable,but there is great difference in the content of aristolochic acid A.
Aristolochia kwangsiensis;Aristolochic acid A;Quality standards;Yaomedicine
R284.1;R917
A
1001-0408(2014)11-1034-04
DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2014.11.26
廣西食品藥品監(jiān)督管理局瑤族習(xí)用藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)研究項(xiàng)目(No.MZY2012009)