高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中甲氧芐啶的殘留

萬譯文，李小玲，鄧克國

（1.農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（長沙），湖南長沙410153；2.湖南省水產(chǎn)科學研究所，湖南長沙410153）

甲氧芐啶為光譜類抗菌藥物，化學名稱是2，4-二氨基-5-（3，4，5-三甲基芐基）嘧啶，抗菌譜與磺胺類藥物類似，主要用于抑制二氫葉酸還原酶。甲氧芐啶作為磺胺類的增效劑，與磺胺類一起使用時，可增強其療效幾倍甚至幾十倍[1]。由于其獨特的作用，甲氧芐啶被廣泛用于畜牧以及水產(chǎn)的養(yǎng)殖過程中，這種藥物的大量使用必然會導致其在動物源性食品中的殘留，嚴重危害人類身體健康。歐盟對動物源性食品中磺胺類和甲氧芐啶的殘留量制定了嚴格的限量要求[2]。我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定，自2011年4月起，新申報的無公害水產(chǎn)品中甲氧芐啶的殘留量最高限制為50 μg/kg[3]。

目前磺胺類和甲氧芐啶常用的檢測方法有微生物法[4]，高效液相色譜法[5]，紫外分光光度法等[6]。由于微生物法屬于一種初篩法，適合大批次樣品的初篩檢驗，但是不能得到殘留藥物的具體種類和濃度。液相色譜法可得到殘留藥物的具體種類和濃度，但是前處理復雜，有機試劑使用較多，同時水產(chǎn)品基質(zhì)的復雜性對樣品定性存在許多干擾，容易造成假陽性的出現(xiàn)。本文建立了水產(chǎn)品中甲氧芐啶的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，該方法提高了色譜分析的功效，簡單快速，靈敏度高，而且節(jié)約成本，能實現(xiàn)了藥物殘留的快速檢測，能滿足水產(chǎn)品質(zhì)檢以及相關基礎研究的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Thermo TSQ Quantum 液相色譜-高分辨串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配用電噴霧離子（ESI）源（Thermo 公司）。超聲波清洗器：昆山超聲波儀器廠；平行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Buchi（布奇）公司；高速冷凍離心機：日本日立公司；微型漩渦混合儀：上海滬西分析儀器廠；精密電子天平：梅特勒—托利多稱重設備系統(tǒng)有限公司。

標準儲備液的配置：稱取甲氧芐啶標準品各10.0 mg，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容配置成100 mg/L 的標準儲備液，用甲醇稀釋成不同濃度的標準工作液在-18 ℃下避光保存。

內(nèi)標儲備液及使用液的配置：稱取10.0 mg 氘代磺胺間二甲氧嘧啶標準品，用甲醇溶解并定容，配成100 mg/L 的標準儲備液，在-18 ℃下避光保存。然后用甲醇逐級稀釋配成1.0 mg/L 的混合內(nèi)標使用液，在-18 ℃下避光保存。

1.2 儀器分析

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Capcell Pak C18（MGⅡ，150 mm×2.1 mm，5 μm）；柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL，流動相A 為甲醇；B 為2 mmoL/L 的乙酸銨溶液（含0.1%的甲酸）；梯度洗脫程序為：0～6 min，10%A～60%A；6 min～8 min，60%A～80%A；8 min～13 min，80%A～90 %A；13 min～14min，90%A～10%A，并保持2min；流速為250μL/min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

采用大氣壓電噴霧離子源（ESI），正離子模式；噴霧電壓為4 000 V；離子傳輸毛細管溫度為350 ℃，Q1半峰寬為0.7 Da；Q3 半峰寬為0.7 Da；碰撞氣氬氣壓力為1.5 mTorr；鞘氣流量為10 L/min；輔助氣流量為2 L/min；采用選擇反應監(jiān)測模式（SRM），甲氧芐啶及其內(nèi)標的母離子、子離子和碰撞能量見表1。

表1 甲氧芐啶的SRM 采集參數(shù)和標準曲線Table 1 SRM paraneters and linear equations for trimethoprim

1.2 樣品前處理

稱取5 g 樣品（精確至0.01 g）置于離心管中，加入10 g 烘干備用的無水硫酸鈉后，立刻用玻璃棒攪勻，然后加入10 mL 乙腈提取液，在漩渦混合儀上充分混合1 min，然后再超聲振蕩20 min，平衡后放入離心機8 000 r/min 離心10 min 待分層，吸取上層清液至25 mL比色管中，重復加10 mL 乙腈提取液提取一次，合并乙腈提取液。中性氧化鋁固相萃取柱（3 mL，60 mg）先用5 mL 乙腈活化，準確移取5 mL 提取液過柱，再用4mL乙腈洗脫，用10 mL 玻璃離心管收集提取液和洗脫液，于40 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。準確加入1.0mL 甲醇-2 mmol/L 乙酸銨溶液（2︰8，V：V，含0.1%甲酸）溶解殘渣，為了防止脂肪和雜質(zhì)的影響，加入2.0mL 正己烷去脂，漩渦混勻1 min，取下層液體過0.22μm 濾膜，供液質(zhì)聯(lián)用儀分析。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的選擇及優(yōu)化

由于水產(chǎn)品成分比較復雜，基質(zhì)中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及色素等雜質(zhì)。本試驗比較了乙腈和正己烷兩種提取液，兩種提取液回收率均滿足要求，但是由于正己烷對脂肪溶解度大，容易造成對質(zhì)譜的污染。而乙腈能提取大多數(shù)目標物，并且提取效果好，乙腈使蛋白質(zhì)變性凝結沉淀下來后通過離心除去；前處理中加入無水硫酸鈉是為了有效除去水產(chǎn)品基質(zhì)當中含有的水分，同時無水硫酸鈉還可以促使蛋白質(zhì)變性分散，防止樣品結成塊狀影響提取效果；最后加入正己烷可溶解一些脂肪、蛋白質(zhì)和色素，經(jīng)離心后除去，過0.22 μm 濾膜后溶液清亮，回收率實驗滿足要求。

2.2 色譜條件的選擇及優(yōu)化

本試驗比對了甲醇-水，甲醇-乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）兩種不同的流動相。當采用甲醇-水為流動相時，甲氧芐啶在1min 之內(nèi)出峰，而出峰時間太快對質(zhì)譜會造成污染，同時峰形有拖尾現(xiàn)象產(chǎn)生；本實驗考慮采用揮發(fā)性電解質(zhì)乙酸銨來做為流動相，同時加入0.1%甲酸控制流動相pH，采用合適的梯度洗脫程序，得到了比較理想的色譜峰，峰形尖銳且對稱性好，增大了分子離子峰的峰強度。色譜圖見圖1。

圖1 魚肉中甲氧芐啶（5.0 μg/L）及其內(nèi)標溶液的提取離子流色譜圖Fig.1 Extraction ion chromatograms of trimethoprim（5.0 μg/L）in fish and their internal solution

2.3 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化

由于甲氧芐啶的分子式為C14H18N4O3，根據(jù)目標物的結構特征（見圖2），甲氧芐啶適合采用ESI 正離子電離模式對1.0 mg/L 的標液進行一級質(zhì)譜Q1 全掃描分析，m/z 掃描范圍為200～400 之間，找到準確的（[M+H]+）峰m/z291 為母離子。接著進行子離子Q3 掃描，選取豐度最強的碎片離子為定量離子，豐度次強的碎片離子為定性離子，同時優(yōu)化錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜條件，使選定的母離子和子離子組成的特征離子的豐度和比例達到最佳。得到1.2.2 中最佳質(zhì)譜條件。

圖2 甲氧芐啶化學結構式Fig.2 The structure of Trimethoprim

2.4 線性范圍和靈敏度

配置0.5 μg/L～100.0 μg/L 的標準溶液，進樣量均為10 μL，內(nèi)標法定量，以標準品與內(nèi)標物峰面積比值Y 為縱坐標，工作溶液的質(zhì)量濃度X（μg/L）為橫坐標制作標準曲線，其回歸方程和相關系數(shù)如表1 所示。結果表明，在此范圍內(nèi)其標準曲線的線性關系良好，相關性系數(shù)r2為0.999 5，說明甲氧芐啶在0.5 μg/L～100.0 μg/L 范圍內(nèi)，峰面積和濃度具有良好的線性關系。經(jīng)測定性噪比（S/N）均大于3，表明這4 種物質(zhì)的檢測下限（LOD）為0.5 μg/kg，其定量下限（LOQ）可為1.0 μg/kg。

2.6 回收率與精密度

在草魚和中華鱉空白樣品中添加5、10、50 ng/g 三個水平的添加實驗，每個添加水平進行3 次實驗，每次平行測定5 次，按1.2 節(jié)所述條件進行加標回收率實驗，所得結果為回收率為77.1%～93.5%，相對標準偏差為1.78%～5.08%，符合國內(nèi)外有關標準和法規(guī)的要求[7]，結果見表2。

表2 甲氧芐啶在空白樣品中的添加回收率和相對標準偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of trimethoprim in blank samples

3 小結

本方法適用于各種不同基質(zhì)的水產(chǎn)品及其制品，前處理方法步驟簡單、試劑用量少、回收率穩(wěn)定、精密度好，滿足我國以及歐盟等國家的限量要求，可以作為水產(chǎn)品及制品中甲氧芐啶藥物的檢測方法，并可為該類藥物在水產(chǎn)品中的消除規(guī)律及毒理評價提供靈敏、準確的分析手段，對水產(chǎn)品的安全工作提供了有力的保障。

[1] 梅光明,陳學昌,張小軍,等.高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中殘留的甲氧芐啶[J].食品科學,2010,31(6):248-251

[2] 林維宣.各國食品中農(nóng)藥獸藥殘留量的規(guī)定[M].大連:大連海事大學出版社,2002:1298-1330

[3] 農(nóng)業(yè)部辦公廳.農(nóng)業(yè)部辦公廳關于印發(fā)茄果類蔬菜等14 類無公害農(nóng)業(yè)品檢測目錄的通知[Z].2011

[4] 孫晶瑋,趙新淮.微生物法檢驗乳中抗生素殘留的局限性[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2007,38(4):507-510

[5] 邵耀東,胡彬,趙小華,等.高效液相色譜法測定甲氧芐啶含量[J].動物醫(yī)學進展,2012,33(5):81-84

[6] 陸有飛,關忠誼.用紫外分光光度法測定痢速寧注射液中甲氧芐氨嘧啶的含量[J].廣西畜牧獸醫(yī),2000,16(2):9-11

[7] Commission of the European Communities. Implementing council directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and interpretation of resuts[S].2002/657/EC