肉桂酰胺格爾德霉素增強腫瘤細胞對力達霉素敏感度的研究

李 良 韓菲菲 甄永蘇

力達霉素(lidamycin，LDM)是利用精原細胞法從我國湖北省潛江縣土壤中分離的鏈霉菌Streptomyces globisporus C-1027中篩選得到的一種烯二炔類抗生素，全部分子結(jié)構(gòu)由1個110個氨基酸的酸性輔基蛋白(MW 10．5kDa)和1個含有九元環(huán)烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(MW 843Da)通過非共價鍵結(jié)合而成［1，2］。LDM具有很強的細胞毒性，其主要機制是引起DNA分子斷裂、損傷，LDM與細胞DNA分子結(jié)合后，經(jīng)伯格曼環(huán)化反應生成雙自由基中間體，所產(chǎn)生的自由基奪取核苷酸核糖骨架的氫原子進而引起細胞DNA斷裂［3，4］。LDM對多種腫瘤細胞都具有明顯的體內(nèi)、體外抗腫瘤活性，其細胞水平的IC50值均為納摩爾水平，因此是研制新型高效抗腫瘤藥物的理想候選藥物。

肉桂酰胺格爾德霉素［17-(6-cinnamamidohexylamino-)-17-demethoxygeldanamycin，CNDG］是本實驗室在前期工作中合成的具有肉桂酰胺結(jié)構(gòu)的格爾德霉素衍生物，其作用靶點是熱休克蛋白90(heat shock protein，HSP90)。HSP90是一種有管家基因表達的的分子伴侶蛋白，主要功能維持細胞內(nèi)蛋白質(zhì)正確構(gòu)象的形成［5］。HSP90在許多腫瘤中都存在過表達的現(xiàn)象，而且許多與腫瘤細胞分化、增生、侵襲密切相關(guān)的靶點分子均受HSP90調(diào)控，如BCRABL、EGFR、Her-2 等［6～9］。目前，正處于臨床研究階段的 HSP90抑制劑主要包括 17-AAG、17-DMAG、IPI-504 和 SNX2112 等［10，11］。近來有研究報道，HSP90抑制劑有增強化療藥物尤其是DNA損傷藥物抗腫瘤活性的作用，這一作用可能與DNA損傷修復相關(guān)信號轉(zhuǎn)導分子受HSP90調(diào)控有關(guān)［12］。本研究擬利用HSP90抑制劑CNDG與LDM聯(lián)合應用，抑制LDM引起DNA斷裂后所激活的DNA損傷修復信號轉(zhuǎn)導途徑，從而增強其抗腫瘤活性。

材料與方法

1．試劑與細胞株:力達霉素與肉桂酰胺格爾德霉素由本實驗室制備。人乳腺癌細胞MCF-7、人肝癌細胞Bel-7402、人肺癌細胞A549有實驗室保存。MTT購自美國Sigma公司，ECL發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司，BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司，細胞培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司、所有抗體均為Cellsignal公司產(chǎn)品。

2．方法:(1)MTT法測定CNDG聯(lián)合LDM對腫瘤細胞存活率的影響:取對數(shù)生長期細胞，以4000～5000/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板。24h后加入不同濃度的藥物處理(LDM(0．05、0．1nmol/L)，CNDG(0．5、1、5μmol/L))，設(shè)至少 3 個平行孔。48h后向每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，37℃溫育4h。吸出上清液，加入150μl DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標儀在570nm處測定每個孔的吸光度(A)值。將各測試孔的A值減去本底A值，各平行孔的A值取平均數(shù)。細胞的存活率以T/C(%)表示，T為加藥組細胞的A值，C為對照組細胞的A值。細胞存活率(%)=(T-本底A值)/(C-本底A值)×100%。兩藥聯(lián)合指數(shù)(combination index，CI)=Vcomb/(VLDM×VCNDG)，Vcomb為聯(lián)合給藥組 T/C 比值，VLDM、VCNDG為單藥組T/C比值。CI＜1表示有協(xié)同作用，CI=1表示有相加作用，CI＞1表示有拮抗作用。(2)CNDG聯(lián)合LDM對腫瘤細胞周期的影響:接種細胞于6孔細胞培養(yǎng)板，CNDG聯(lián)合LDM藥物處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細胞，1000r/min 4℃離心10min。重懸細胞，乙醇4℃固定。PI染色前，細胞用PBS洗兩遍，然后重懸于PI染液中，37℃避光染色30min。細胞經(jīng)過濾后用流式細胞儀測定DNA含量并分析細胞周期分布。(3)Western blot法檢測CNDG聯(lián)合LDM對腫瘤細胞ATRIP、c-PARP水平的影響:取藥物處理后細胞株，根據(jù)不同實驗要求在不同時間收集培養(yǎng)細胞。提取細胞總蛋白并用BCA試劑盒測定蛋白含量。SDS-PAGE電泳后取出凝膠，轉(zhuǎn)PVDF膜。1%BSA封閉2h，加入1∶1000稀釋的一抗，室溫孵育2～3h，TBST洗膜3次;加入1∶5000稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育2～3h，TBST洗膜6次。以ECL試劑盒檢測蛋白條帶，凝膠成像系統(tǒng)照相并保存分析結(jié)果。(4)免疫熒光檢測CNDG聯(lián)合LDM對腫瘤細胞γH2AX水平的影響:在不同時間用藥物處理細胞，LDM和CNDG單獨或聯(lián)合處理;細胞經(jīng)藥物處理后用4%多聚甲醛固定30min，用PBS洗3次，0．1%NP-40 PBS-T打孔30min，1%BSA封閉1h，一抗孵育4℃過夜，用PBS洗3次，加入熒光標記的二抗37℃避光孵育1h，Hochest33258復染，50%甘油-PBS封片以防熒光淬滅，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

結(jié) 果

1．CNDG增強LDM對腫瘤細胞增生抑制作用:MTT法檢測CNDG與LDM聯(lián)合應用對人乳腺癌MCF-7、人肝癌Bel-7402、人肺癌A549細胞增生的影響，并計算聯(lián)合指數(shù)。結(jié)果表明，CNDG 1、5μmol/L能明顯增強LDM對腫瘤細胞增生抑制作用，CNDG與LDM 0．05nmol/L聯(lián)合給藥對3種腫瘤細胞的CI值＜1，顯示協(xié)同作用(圖1)。

2．CNDG改變LDM對腫瘤細胞周期的阻滯作用:LDM給藥24h作用后對腫瘤細胞的G2/M期阻滯顯著，MCF-7細胞從3．14%升高至47．76%，加入CNDG后G2/M期從47．76%下降到30．28%，G1期細胞增加。Bel-7402細胞從80．61%下降到60．43%。A549細胞從24．86%下降到8．29%(圖2)。

3．CNDG與LDM聯(lián)合影響腫瘤細胞DNA損傷修復相關(guān)信號轉(zhuǎn)導分子蛋白水平:Western blot法檢測與凋亡相關(guān)的PARP的切割水平，LDM與CNDG兩藥單藥PARP的切割水平變化不明顯，兩種藥物聯(lián)合PARP切割水平顯著提高。另外，LDM單藥可增加MCF-7細胞ATRIP的水平，與CNDG聯(lián)合應用使ATRIP蛋白水平顯著下降(圖3)。

4．CNDG與LDM聯(lián)合對腫瘤細胞γH2AX的影響:γH2AX是細胞DNA損傷后可迅速聚集于細胞核DNA損傷部位的蛋白因子，其磷酸化水平反應細胞DNA損傷程度。γH2AX常用來表示DNA雙鏈斷裂程度。用免疫熒光的方法檢測A549細胞經(jīng)過CNDG和LDM處理后細胞內(nèi)γH2AX水平以測定細胞內(nèi)的DNA雙鏈斷裂水平，LDM給藥1h后γH2AX陽性的細胞比例升高，經(jīng)CNDG預處理的細胞γH2AX的熒光強度增強，表明DNA雙鏈斷裂水平增加(圖4)。

討 論

LDM屬于九元環(huán)烯二炔類抗生素，具有高效細胞毒活性，其體內(nèi)、體外抗腫瘤活性明顯。這些作用均源于LDM與細胞DNA結(jié)合后自由基對DNA的斷裂作用。腫瘤細胞經(jīng)放療、化療等作用于DNA的治療方式后可引起DNA損傷后修復，而這一過程可能會引起腫瘤細胞耐藥。因此尋找靶向DNA損傷修復的藥物是對抗腫瘤細胞耐藥、增敏化療藥物的有效策略。DNA損傷后修復是細胞DNA受損后的自發(fā)反應，其中ATM/ATR信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮重要作用，ATM和ATR通過對下游信號分子的一系列磷酸化觸發(fā)DNA修復［13］。作用于 DNA的藥物通過 ATM、ATR等信號轉(zhuǎn)導途徑使腫瘤產(chǎn)生G2/M期阻滯，在此阻滯期細胞對受損DNA進行修復。這一機制對細胞的存活有重要的意義，低劑量DNA損傷藥物或低劑量射線作用下，細胞可以通過這種修復的方式順利的存活，當DNA損傷程度超出修復能力或修復機制受到干擾時會誘導腫瘤細胞死亡［14］。本研究選擇了前期工作中得到的HSP90抑制劑CNDG作為LDM的增敏劑，實驗結(jié)果顯示LDM與HSP90抑制劑的聯(lián)合給藥大大增強了腫瘤殺傷作用，腫瘤細胞PARP的切割水平明顯提高，達到了顯著地協(xié)同作用。

圖1 CNDG與LDM聯(lián)合給藥對MCF-7、Bel-7402、A549腫瘤細胞增生抑制作用

圖2 CNDG聯(lián)合LDM影響腫瘤細胞周期

圖3 CNDG與LDM聯(lián)合對腫瘤細胞DNA損傷修復相關(guān)c-PARP和ATRIP的影響

圖4 用γH2AX分析A549細胞對DNA雙鏈斷裂的修復水平

在分子水平上，LDM單藥組γH2AX的水平降低，雙鏈斷裂較少，而CNDG預處理組的γH2AX則顯著增加，這一結(jié)果表明CNDG可以增強力達霉素對DNA的雙鏈斷裂作用。有研究報道，細胞接觸LDM后即會同時激活ATM、ATR兩條通路，與其他藥物作用機制略有不同，LDM對兩條通路可同時激活，且沒有優(yōu)先次序［15］。因此，只要二者之一激活的情況下即可誘導DNA的損傷后的細胞周期阻滯和DNA修復。單獨抑制ATM或ATR通路并不能有效抑制腫瘤細胞的DNA修復。而CNDG可能通過抑制HSP90的活性進而抑制ATM/ATR兩條通路以降低DNA的損傷后修復能力，增強腫瘤細胞對LDM的敏感度，因為ATM、ATR的活性均受 HSP90調(diào)控。ATRIP在DNA損傷后修復應答過程中同樣具有重要作用，ATR發(fā)揮功能需要與ATRIP形成復合物。在本研究中，腫瘤細胞經(jīng)CNDG處理后，ATRIP的水平顯著下降，CNDG可以降低ATRIP的總蛋白水平，從而影響ATR通路的活性，降低了LDM作用后腫瘤細胞的DNA修復能力。

綜上所述，本研究結(jié)果表明HSP90抑制劑CNDG能夠明顯增強腫瘤細胞對烯二炔類抗生素LDM的敏感度，作用機制可能與HSP90被抑制后DNA損傷修復相關(guān)信號轉(zhuǎn)導因子蛋白水平及生物活性降低有關(guān)。同時針對DNA損傷修復機制研究新型抗腫瘤藥物有可能是一種有效的抗腫瘤藥物研究策略。

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