玉米芯復(fù)合酶法制備低聚木糖工藝的研究

湯衛(wèi)華，殷海松，劉鵬，龍尾

（天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津300350）

低聚木糖（xylo-oligosaccharide，XO）是水解木聚糖的β-1，4-糖苷鍵，產(chǎn)物是以木二糖、木三糖和木四糖等組成的木寡糖混合物[1]。低聚木糖甜味純正，難被人體消化吸收，腸道內(nèi)殘存率高，具有極好的雙歧桿菌增殖性，其選擇利用性高于其他功能性低聚糖[2]，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

制備低聚木糖的主要方法包括酸水解法，熱水抽提法，酶水解法和微波降解法四種。由于酸水解法要求高、設(shè)備投入大、反應(yīng)產(chǎn)物復(fù)雜；熱水抽提產(chǎn)物色澤深、精制工藝繁瑣；微波降解法仍處于實(shí)驗(yàn)室階段[3]。因此酶法是目前水解木聚糖最常采用的方法。

木聚糖是半纖維素的一種，植物細(xì)胞壁中的結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖，在植物細(xì)胞壁中的含量僅次于纖維素。在植物細(xì)胞壁中，木質(zhì)素中的阿魏酸、對香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸類物質(zhì)以酯鍵方式與半纖維素支鏈形成致密網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，從空間上限制微生物對植物細(xì)胞壁中纖維素和半纖維素的有效降解，這也是影響木聚糖酶酶解效率的主要因素之一[4]。因此，要提高木聚糖酶酶解效率，首先要破壞半纖維素與木質(zhì)素、纖維素的交聯(lián)架構(gòu)，而單一的酶不可能對所有的糖苷鍵產(chǎn)生作用，因此要完全降解木聚糖需要幾種不同酶的協(xié)同作用。本文研究阿魏酸酯酶，木聚糖酶和漆酶復(fù)合使用時(shí)，可以通過協(xié)同作用有效降解致密網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)植物細(xì)胞壁半纖維素的酶解產(chǎn)率，提高酶解液中低聚木糖的含量，為后續(xù)產(chǎn)品的分離純化打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米芯：市售；漆酶（1.2×105IU/g）、阿魏酸酯酶（1.5×104IU/g）、木聚糖酶（1.5×104IU/g）：寧夏夏盛集團(tuán)；其他化學(xué)試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

F2102 型粉碎機(jī)：天津泰斯特儀器有限公司；ZNXMTF-2000 酶解罐：鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司；SHA-BA 恒溫振蕩器：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；Delta-320 型酸度計(jì)：梅特勒－托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玉米芯的預(yù)處理

選擇風(fēng)干的、無發(fā)霉的玉米芯用粉碎機(jī)粉碎過80目篩，備用。

1.3.2 復(fù)合酶制劑酶解玉米芯制備低聚木糖的正交試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以低聚木糖的得率為考察指標(biāo)，進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合酶制劑的配比，正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table1 Factors and levels in orthogonal experiment

1.3.3 低聚木糖含量及得率的測定[5]

依據(jù)3，5-二硝基水楊酸法（DNS 法）測定酶解液中還原糖含量，以還原糖含量代表酶解后的低聚木糖含量。

低聚木糖產(chǎn)率（%）=酶解液還原糖含量（g/L）×酶解液體積（L）/玉米芯干重×100%

1.3.4 復(fù)合酶制劑的作用條件對低聚木糖產(chǎn)量的影響

1.3.4.1 反應(yīng)溫度對低聚木糖含量的影響

料液比為1∶20，反應(yīng)時(shí)間為4 h，考察反應(yīng)溫度為30、40、50、60、70 ℃下作用5 h 后，測定低聚木糖的含量。

1.3.4.2 反應(yīng)時(shí)間對低聚木糖含量的影響

料液比為1∶20，反應(yīng)溫度為50 ℃，考察復(fù)合酶制劑作用0、2、4、6、8 h 后，測定低聚木糖的含量。

1.3.4.3 料液比對低聚木糖含量的影響

將料液比調(diào)至1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40，復(fù)合酶制劑反應(yīng)時(shí)間為4 h，反應(yīng)溫度為50 ℃，測定低聚木糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶制劑的配比對低聚木糖含量的影響

按照1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)，復(fù)合酶制劑加入到料液比為1∶20 的玉米芯，于55 ℃下水解6 h，計(jì)算低聚木糖的得率，正交結(jié)果分析見表2，方差分析見表3。

表2 正交結(jié)果分析Table2 Orthogonal Results

表3 方差分析表Table3 Variance analysis of results

由表2和表3可以看出阿魏酸酯酶（A）、漆酶（B）及木聚糖酶（C）的影響順序?yàn)镃>B>A，組合A2B3C2最好，即阿魏酸酯酶0.2%、漆酶0.3%和木聚糖酶0.6%。

2.2 復(fù)合酶制劑的酶解條件對低聚木糖得率的影響

按照1.3.5 的條件，考察水解溫度、水解時(shí)間和料液比對低聚木糖得率的影響，結(jié)果如圖1（a），1（b），1（c）所示。

圖1 復(fù)合酶制劑酶解條件對玉米芯中低聚木糖得率的影響，1（a）水解溫度；1（b）水解時(shí)間；1（c）料液比（g∶mL）Fig.1 Effect of hydrolysis conditions on xylooligosaccaride yield，1（a）hydrolysis temperature；1（b）hydrolysis temperature time；1（c）solid-liquid ratio

圖1（a）顯示，隨著酶解溫度的提高，酶解產(chǎn)物低聚木糖得率也提高，當(dāng)溫度提高至50 ℃，低聚木糖得率達(dá)到65.2%，進(jìn)一步提高水解溫度，低聚木糖得率不再提高，因此選擇復(fù)合酶制劑的水解溫度選擇為50 ℃。圖1（b）的結(jié)果顯示，低聚木糖的得率隨著水解時(shí)間提高而增加，當(dāng)水解時(shí)間達(dá)到4 h 后，再繼續(xù)水解，低聚木糖得率增加速度緩慢，因此選擇復(fù)合酶制劑的水解時(shí)間為4 h。從圖1（c）可知，料液比為1∶20時(shí)，低聚木糖的得率達(dá)到最高，為68.5 %，因此酶解料液比選擇1∶20（g∶mL）。

在水解溫度為50 ℃、水解時(shí)間為4 h、料液比為1∶20 的條件下，復(fù)合酶制劑酶解玉米芯后，低聚木糖的含量達(dá)到16.8 mg/mL，比單一酶制劑木聚糖酶的作用提高了64.7%（圖2）。

由圖2可知，復(fù)合酶制劑中漆酶和阿魏酸酯酶起到很好的協(xié)同作用，阿魏酸酯酶，又稱為肉桂酸酯酶，是一種羧酸酯水解酶，可以水解阿魏酸與半纖維素之間的酯鍵，從而破壞細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)，使原料結(jié)構(gòu)更為疏松[6]。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶，可以破壞玉米芯中半纖維素酯鍵，有效降解細(xì)胞壁中的木質(zhì)素，削弱木質(zhì)素對半纖維素木聚糖的屏蔽作用[7-8]。在漆酶和阿魏酸酯酶的共同作用下，使玉米芯中木聚糖從細(xì)胞壁中大量釋放出來，木聚糖更容易結(jié)合至木聚糖酶的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)玉米芯的降解和低聚木糖的產(chǎn)生。

圖2 復(fù)合酶制劑和單一酶制劑的酶解效果比較Fig.2 Changes of xylooligosaccaride yield on compound enzyme and single enzyme hydrolysis

3 結(jié)論

正交試驗(yàn)確定復(fù)合酶制劑影響順序?yàn)槟揪厶敲?漆酶>阿魏酸酯酶，復(fù)合酶制劑中阿魏酸酯酶、漆酶和木聚糖酶添加量分別為0.2%、0.3%和0.6%。復(fù)合酶制劑的反應(yīng)條件分別是水解溫度為50℃、水解時(shí)間為4 h、料液比為1∶20（g∶mL）。在最適條件下復(fù)合酶制劑處理玉米芯原料后，低聚木糖含量達(dá)到16.8 mg/mL，比單一酶制劑木聚糖酶提高了64.7%。

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