牦牛TLR2基因的克隆及序列分析＊

林寶山，蘭道亮，黃 偲，陳亞冰，黃 勇，李 鍵．＊

（1．西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2．西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都610041）

牦牛TLR2基因的克隆及序列分析＊

林寶山1，蘭道亮2，黃 偲1，陳亞冰1，黃 勇1，李 鍵1．2＊

（1．西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；2．西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都610041）

為了解牦牛天然免疫受體TLR2基因特點(diǎn)，根據(jù)GenBank中已公布的牛TLR2基因序列分段設(shè)計引物，克隆并對所得結(jié)果進(jìn)行序列分析?；蛐蛄蟹治霰砻?，克隆得到牦牛TLR2基因編碼區(qū)全長2 620 bp，開放閱讀框2 355 bp，編碼氨基酸784個，分子質(zhì)量90．024 6 ku，理論等電點(diǎn)為6．46。蛋白預(yù)測結(jié)果表明，TLR2編碼蛋白整體表現(xiàn)為親水性。同源性分析表明，11條序列中牦牛與野牦牛、普通牛、綿羊等物種具有較高的同源性，在系統(tǒng)發(fā)育樹中距離最近。結(jié)果說明TLR2基因序列具有較高的保守性。牦牛TLR2基因序列的成功克隆對牦牛及高原動物抗病及免疫應(yīng)答分子機(jī)制等研究提供理論基礎(chǔ)。

Toll樣受體2；基因克??；序列分析；牦牛

Toll樣受體（TLRs）作為一類重要的天然免疫模式識別受體，可通過病原相關(guān)模式分子（pathogen－associated molecular patterns，PAMPs）識別病原微生物，在天然免疫系統(tǒng)、感染和炎癥期間檢測病原微生物配體等發(fā)揮著“哨兵”的重要作用［1］。截至目前，在哺乳動物和人上已發(fā)現(xiàn)的TLRs有11種（TLR1～TLR11），其中TLR2因其表達(dá)范圍最廣、識別病原微生物及其產(chǎn)物種類最多而成為Toll樣受體家族中研究較多的一類重要受體，其在巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞表面均有表達(dá)［2］。近年來隨著研究的不斷深入，其在免疫應(yīng)答中的功能與發(fā)揮的作用越來越受學(xué)者的關(guān)注。大量研究證明，TLR2受體能夠識別大多數(shù)病原微生物及其產(chǎn)物，能夠識別革蘭陽性菌的肽聚糖和脂磷壁酸、革蘭陰性菌的類脂A、分支桿菌和脂蛋白與脂肽和細(xì)菌 DNA 等［3－4］。此外，TLR2能直接識別病毒蛋白，如人巨細(xì)胞病毒蛋白與麻疹病毒的血凝素。除了識別病毒顆粒外，還識別真菌的甘露聚糖。研究發(fā)現(xiàn)，TLR2還參與輪狀病毒引發(fā)的宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)的啟動和調(diào)節(jié)。TLR2除了在細(xì)菌、病毒、真菌等感染中發(fā)揮作用外，對其他一些病原體或組分也可以識別和結(jié)合，如支原體脂蛋白、螺旋體的脂蛋白與脂肽及一些寄生蟲等［5－6］。因此，深入了解TLR2不僅有重要的理論意義，并且具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

牦牛作為高原古老物種能夠在青藏高原高寒、低氧等惡劣氣候環(huán)境下生存，其抗病的免疫機(jī)制與普通牛等低海拔動物相比存在特殊性，研究其免疫機(jī)制對研究其他高原模式動物免疫機(jī)制有借鑒意義。此外，牦牛疾病尤其是重大疫病發(fā)病有逐年上升的趨勢，嚴(yán)重阻礙了牦牛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。研究其抗病分子機(jī)制對牦牛疫病的防控具有重要意義。TLRs作為天然免疫受體，在機(jī)體發(fā)生感染過程中發(fā)揮著非常重要的作用。TLRs在牛、綿羊、人、兔、小鼠及禽類等多個物種都已有相關(guān)研究報道［7－8］。但其在牦牛病原感染等相關(guān)方面的研究尚未見報道。本研究首次克隆牦牛TLR2基因，并對所得序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析及預(yù)測，為今后研究高原牦?？共》肿訖C(jī)制及高原動物的模式免疫機(jī)制具有重要意義。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試劑 大腸埃希菌DH 5α為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；p MD 19－T克隆載體為寶物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒為Axygen（北京）公司產(chǎn)品；Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶為Fermentas公司產(chǎn)品。

1．1．2 試驗(yàn)用動物 試驗(yàn)所用材料為牦牛脾組織，采自成都市青白江區(qū)唐家寺向陽牛市屠宰場，屬于麥哇品種牦牛（四川阿壩）。

1．2 方法

1．2．1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中牛TLR2（登錄號：NM－174 197．2）基因序列，用Premier 5．0軟件分3段設(shè)計引物，引物序列與預(yù)期擴(kuò)增片段長度如表1，引物由上海Invitrogen公司合成。

表1 TLR2基因的引物序列Table 1 Primer sequences of TLR2 gene

1．2．2 組織RNA的提取和cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成 根據(jù)總RNA裂解液Trizol說明書，按每100 mg牦牛脾臟組織加入1 m L Trizol液研磨提取總RNA；按照Fermentas公司的Revert AidTMFirst Strand c DNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄酶說明書，采用20μL體系：Oligo（d T）18 1μL，5×Reaction buffer 4μL，RibolockTMRwase Inhibitor（20μ／μL）1μL，10 mol／L d NTP Mix 2μL，Revert AidTMM－Mu LV Reverse Transcriptase（200μ／μL）1μL，模板1μL，最后用RNase Free d H2O補(bǔ)足20μL，按以下程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42℃60 min；70℃5 min，合成第1鏈cDNA，置－20℃保存。

1．2．3 目的基因的克隆 以牦牛脾臟組織cDNA為模版，引物為S1、A1、S2、A2、S3、A3進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為50μL。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增結(jié)果，用Axygen的凝膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物，取適量已純化PCR產(chǎn)物與克隆載體p MD19－T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH 5α感受態(tài)細(xì)胞并在含Amp＋瓊脂平板上涂菌。挑取單個菌落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中。經(jīng)PCR鑒定后，將陽性重組質(zhì)粒送往Invitrogen（上海）公司測序。

1．2．4 目的基因序列分析 將測序結(jié)果拼接，并用DNA Star軟件、Bio XM軟件、Cltulax軟件以及http：／／npsa－pbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa－automat．plpage＝npsa－gor4．html等在線軟件對序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2．1 目的基因的擴(kuò)增

牦牛TLR2基因分3段擴(kuò)增，分段擴(kuò)增結(jié)果如圖1。3個擴(kuò)增片段大小分別在903、1 071、1 132 bp左右，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小基本相符。

圖1 牦牛TLR2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 PCR products of TLR2 gene in yak

2．2 基本理化性質(zhì)分析

擴(kuò)增得到牦牛TLR2基因編碼區(qū)全長3 620 bp（GenBank登錄號：KF977429），并通過http：／／web．expasy．org／protparam／等生物信息學(xué)在線軟件對其基本理化性質(zhì)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，TLR2基因開放閱讀框全長2 355 bp，編碼氨基酸784個，分子質(zhì)量90．024 6 ku，理論等電點(diǎn)為6．46。氨基酸組成中，正電荷殘基為84個，負(fù)電荷殘基為90個，整個蛋白帶負(fù)電荷。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為41．90，提示該蛋白可能為不穩(wěn)定蛋白。

2．3 TLR2基因編碼產(chǎn)物親、疏水性，柔韌性及抗原性預(yù)測

用DNA Star軟件子程序Prostean對TLR2基因編碼產(chǎn)物的親、疏水性，柔韌性及抗原性進(jìn)行預(yù)測，由圖2可知，TLR2基因親水性殘基所占比例大于疏水性殘基，因此推測其編碼蛋白整體表現(xiàn)為親水性。柔韌性區(qū)域分布相對均勻。抗原表位區(qū)域較大，與柔韌性區(qū)域和表面可能性區(qū)域出現(xiàn)了較多的重疊區(qū)，這些區(qū)域相對易于變形，便于抗原、抗體的自由結(jié)合，可能是抗原位點(diǎn)的富集區(qū)。

2．4 TLR2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

運(yùn)用在線軟件 （http：／／npsa－pbil．ibcp．fr／cgi－bin／npsa－automat．plpage＝ npsa－gor4．html）對TLR2編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，如圖3所示，該蛋白α－螺旋（Alpha helix）占34．44%；自由卷曲（random coil）占 47．32%；延 伸 鏈 （extended strand）占18．24%。

圖2 牦牛TLR2基因親水性、柔韌性及抗原性的預(yù)測結(jié)果Fig．2 Predict results of hydrophilicity，flexibility，surface probability and antigenicity of TLR2 in yak

圖3 TLR2蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig．3 The predicton of secondary structure of TLR2 protein

2．5 同源性分析

利用DNA Star軟件子程序Meg Align的Clustal W方法與GenBank中公布的部分物種TLR2基因序列進(jìn)行同源性比較結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，牦牛TLR2基因與其他11條序列相比，同源性最高的是野牦牛和牛的TLR2基因序列，分別為99．8%和99．0%；最低的是斑點(diǎn)叉尾鮰和紅鰭東方鲀，為28．6%和25．8%；與家犬、人、獼猴、綿羊、野豬、馬的同源性都高于85%；與小家鼠的同源性為73．7%。該結(jié)果說明TLR2基因在哺乳動物間具有較高的保守性。

2．6 遺傳進(jìn)化樹

用 MEGA 5．0 軟件 Neighbor－Joining法重復(fù)1 000次，將獲得的12條TLR2基因序列構(gòu)建Boot－strap驗(yàn)證的系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹，如圖5所示。牦牛與野牦牛和牛TLR2基因的親緣關(guān)系最近，并與綿羊、野豬、馬、家犬、獼猴、人、小家鼠形成哺乳動物的一個分支，然后斑點(diǎn)叉尾鮰和紅鰭東方鲀形成一個與牦牛遺傳距離較遠(yuǎn)的分支。

3 討論

圖4 TLR2基因的核苷酸序列同源性比較Fig．4 Homologus alignment of TLR2 gene sequences

圖5 TLR2基因的核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig．5 Phylogenetic tree of TLR2 gene sequences

TLRs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類天然免疫受體，在機(jī)體天然免疫防御及病原感染過程中發(fā)揮著重要作用［9］，它們可以直接識別結(jié)合某些病原體或其產(chǎn)物所共有的高度保守的特定分子結(jié)構(gòu)，即病原相關(guān)分子 模 式 （pathogen－associated molecular patterns，PAMPs），引發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致炎性介質(zhì)的 釋放，并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)［10－11］。TLR2作為TLRs家族的重要成員，其在病原微生物識別以及在機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮的功能與作用越來越受到重視［12］。牦牛因其能夠在青藏高原高寒、低氧等惡劣氣候環(huán)境下生存，被認(rèn)為是研究高原動物環(huán)境適應(yīng)性、高原動物免疫機(jī)制等方面模式動物。近年來，TLRs在牛、綿羊、人、兔、小鼠及禽類等多個物種都已有相關(guān)研究報道［13－15］，而 TLRs在牦牛上的研究尚未見報道。本研究首次成功克隆了牦牛TLR2基因，并對所得序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析及預(yù)測，為今后深入研究牦牛免疫分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

本研究利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對所得序列進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示牦牛TLR2基因的m RNA序列與野牦牛相比僅存在17個堿基的差異，同源性為99．8%，但并未導(dǎo)致氨基酸序列的改變。同時，與牛的同源性達(dá)到了99%；與其他哺乳動物的同源性也達(dá)到80%以上，這說明在近緣物種，尤其在哺乳動物中TLR2具有較高的保守性。由此推測該基因具有非常重要的生理功能，其表達(dá)的蛋白質(zhì)對于不同物種都有著重要意義。此外，牦牛與牛、綿羊等內(nèi)地平原物種相比生活生長環(huán)境惡劣，同等條件下對高寒低氧所致疾病的抵抗能力相對較強(qiáng)，但其在TLR2基因上卻表現(xiàn)出相當(dāng)高同源性，這提示我們這種差異有可能存在于編碼區(qū)之外的區(qū)域，如啟動子區(qū)域或是由于甲基化等表觀遺傳學(xué)上的差異造成。

本研究首次克隆了牦牛TLR2基因，并進(jìn)行了相關(guān)序列分析，旨在為進(jìn)一步深入研究TLR2基因在牦?？共C(jī)制等方面所發(fā)揮的功能和作用提供基礎(chǔ)。試驗(yàn)后續(xù)將對不同氧分壓下生活的同種牦牛各主要器官TLR2表達(dá)量進(jìn)行定量分析，并與不同海拔近緣動物進(jìn)行對比，以確定TLR2基因的表達(dá)是否存在明顯差異性，從而進(jìn)一步揭示TLR2基因在牦牛疾病免疫應(yīng)答機(jī)制中所發(fā)揮的作用。

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Cloning and Sequence Analysis of TLR2 Gene from Yak

LIN Bao－shan1，LAN Dao－liang2，HUANG Cai1，CHEN Ya－bing1，HUANG Yong1，LI Jian1，2

（1．CollegeofLifeScienceandTechnology，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China；2．CollegeofTibetanPlateauResearch，SouthwestUniversityforNationalities，Chengdu，Sichuan，610041，China）

To understand the characteristics of the yak innate immune receptors TLR2 gene，the primers were designed according to the published cattle TLR2 gene sequence in the Gen Bank．TLR2 gene was divided into three sections for amplification，sequencing，splicin and for bioinformatics analysis and prediction．The results of sequence analysis showed that the length of the cloning TLR2 cDNA is 2 620 bp，containing a complete 2 355 bp open reading frame（ORF）．It encodes a peptide of 784 amino acids whose calculated molecular weight is 90．024 6 ku；PI is 6．46．The results of protein prediction showed that TLR2 protein performs as the hydrophilicity．Sequence homology analysis showed that yak has higher homology with wild yak，cattle，sheep and other species among the 11 sequences，which has the nearest perimeter in the phylogenetic tree．The results showed that TLR2 gene sequence is very conserved in mammals．The successful cloning of TLR2 gene sequence of yak provides further insight into the study on the disease resistance and molecular mechanism of immune response of yak and other plateau animals in Qinghai Tibet Plateau．

TLR2；gene cloning；sequence analysis；yak

S858．23；Q785

A

1007－5038（2014）07－0059－05

2013－12－24

西南民族大學(xué)2014年研究生“創(chuàng)新型科研項(xiàng)目”（CX2014SZ98）

林寶山（1987－），男，甘肅天祝人，碩士研究生，主要從事高原動物免疫分子機(jī)制研究。＊通訊作者