紅色原雞IFN－γ基因的克隆及原核表達(dá)＊

孫亭亭，馬志亮，冀 斌，胡文麗，陳培富

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

紅色原雞IFN－γ基因的克隆及原核表達(dá)＊

孫亭亭，馬志亮，冀 斌，胡文麗，陳培富＊

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650201）

應(yīng)用能夠選擇性克隆同源雙鏈DNA的方法（PCR＋1）從刀豆蛋白A誘導(dǎo)的紅色原雞外周血淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增γ干擾素（IFN－γ）編碼區(qū)基因，雙酶切后連接至克隆載體p UC18。以陽(yáng)性質(zhì)粒為模板擴(kuò)增IFN－γ成熟肽基因，連接至原核表達(dá)載體p ProEXTMHTb，篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒HTb－IFN－γ；重組質(zhì)粒在大腸埃希菌BL21（DE3）中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)SDS－PAGE和Western blot進(jìn)行分析。結(jié)果表明，采用PCR＋1方法擴(kuò)增得到560 bp IFN－γ編碼區(qū)基因，成功連接至克隆載體并以此為模板擴(kuò)增出473 bp成熟肽基因，構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒HTb－IFN－γ在BL21（DE3）中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出分子質(zhì)量約為21 ku的IFN－γ。Western blot分析顯示，表達(dá)的IFN－γ能夠與抗IFN－γ多克隆抗體特異性反應(yīng)，具有良好的免疫活性。

紅色原雞；IFN－γ；不對(duì)稱PCR；原核表達(dá)

紅色原雞屬于原雞屬，有5個(gè)亞種［1］，主要分布于東南亞一帶，其中滇南亞種多分布于云南西部、西南部和南部。紅色原雞具有野性足、抗病力強(qiáng)、耐粗放飼養(yǎng)、適應(yīng)性廣、繁殖力強(qiáng)、能與家雞雜交產(chǎn)生有繁殖力的后代等特點(diǎn)［2］，作為一個(gè)重要的禽類品種資源應(yīng)用潛力很大。

γ干擾素 （interferon－gamma，IFN－γ）是Ⅱ型干擾素，主要由活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，能夠激活巨噬細(xì)胞分泌抗炎癥因子、刺激MHCⅡ分子的表達(dá)，能夠促進(jìn)B細(xì)胞分化、產(chǎn)生抗體及免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換，比Ⅰ型干擾素具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能［3］，因此又稱為免疫干擾素。雞IFN－γ基因位于1號(hào)染色體，當(dāng)用普通的PCR擴(kuò)增時(shí)能同時(shí)擴(kuò)增2條同源染色體上的等位基因，如果IFN－γ基因是純合子，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的都是相同的雙鏈DNA；如果等位基因是雜合子，則等位之間有多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP），在擴(kuò)增過(guò)程中將產(chǎn)生有錯(cuò)配堿基的雙鏈DNA。這些錯(cuò)配的堿基克隆至宿主菌后會(huì)得到隨機(jī)修復(fù)，將隨機(jī)產(chǎn)生多種與原基因不相符的核酸序列。PCR＋1方法是不對(duì)稱PCR擴(kuò)增，通過(guò)加入不等量上、下游引物最終獲得的雙鏈DNA中，只有與原基因完全相同的才帶有雙酶切位點(diǎn)，才能通過(guò)雙酶切后連接至載體進(jìn)行克隆。

本研究應(yīng)用PCR＋1方法成功克隆得到IFN－γ編碼區(qū)基因，并以其為模板擴(kuò)增得到成熟肽基因，構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒 HTb－IFN－γ在E．coliBL21（DE3）中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)能夠表達(dá)出具有免疫活性的IFN－γ。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試驗(yàn)用動(dòng)物 云南省德宏、普洱、紅河等地區(qū)收集成年紅色原雞。

1．1．2 主要試劑 雞外周血淋巴細(xì)胞分離液，為天津?yàn)笊镏破房萍加邢薰井a(chǎn)品；刀豆蛋白A（Con A），為北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；改良型RPMI－1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清，為HyClone公司產(chǎn)品；RT－PCR相關(guān)試劑、p UC18克隆載體、E．coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞及工具酶，為Ta KaRa公司產(chǎn)品；p ProEXTMHTc表達(dá)載體、E．coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞、抗IFN－γ多克隆抗體，為Invitrogen公司產(chǎn)品；沉淀型TMB溶液，為天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

1．1．3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank提供的IFN－γ基因序列（NM－205149．1）設(shè)計(jì)引物（下劃線為酶切位點(diǎn)），其中用于PCR＋1方法擴(kuò)增IFN－γ編碼區(qū)基因的引物有3條：IFNG－F1：5′－GCCATCACCAAGAAGATGACTT－3′，IFNG－F1－EcoRⅠ：5′－CG GAATTCCGGCCATCACCAAGAAGATGACTT－3′和 IFNG－R1－XbaⅠ：5′－GCTCTAGAGCGTGCATTGTAAAATTTAAAATAGTTGAGC－3′，擴(kuò)增片段大小為560 bp；擴(kuò)增成熟肽基因的引物：IFNG－F2：5′－CGGAATTCCGGATGATGATGATAAACATACTGCAAGTAGTCTAAATCT－3′， IFNG－R2：5′－GCTCTAGAGCTTAGCAATTGCATCTCCTCTG－3′，擴(kuò)增片段大小為473 bp。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1．2 方法

1．2．1 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 雞翅下靜脈采抗凝血3 m L，按照雞外周血淋巴細(xì)胞分離液使用說(shuō)明分離外周血淋巴細(xì)胞。用1640細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)至1×107個(gè)／m L鋪于24孔板中，加入終濃度為20μg／m L Con A，37℃培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，離心棄上清，用RNAiso Plus重懸后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，置－20℃保存。

1．2．2 PCR＋1方法擴(kuò)增目的基因 參照Borriello F等［4］的方法進(jìn)行PCR＋1擴(kuò)增目的基因操作步驟為：配制30μL反應(yīng)體系，其中cDNA 2μL，dd H2O 20 μL，buffer （Mg2＋）3 μL，d NTP（2．5 mmol／L）2．5μL，引物IFNG－F1與IFNG－R1－XbaⅠ混合液2μL（IFNG－F1和IFNG－R1－XbaⅠ分別稀釋成10μmol／L后按體積比1∶10混合），ExTaq0．5μL；擴(kuò)增條件：94℃ 預(yù)變性5 min；94℃30 s，58℃40 s，72℃40 s 34個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，立即向體系中加入1μL IFNG－F1－EcoRⅠ（100μmol／L），再進(jìn)行1個(gè)循環(huán)，最后72℃8 min終延伸。10 g／L瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴(kuò)增結(jié)果。

1．2．3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 將PCR＋1產(chǎn)物純化后進(jìn)行EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切，克隆載體p UC18也進(jìn)行同樣的雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后在T4 DNA Ligase作用下16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含Amp的LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單菌落振蕩培養(yǎng)，提取的質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切鑒定均為陽(yáng)性的命名為p UCIFN－γ，置－80℃保存。

以質(zhì)粒 p UC－IFN－γ為模板用引物IFNG－F2／R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體pPro－EXTMHTb分別進(jìn)行EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切后T4 DNA Ligase連接，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切鑒定均為陽(yáng)性的送華大基因公司測(cè)序，測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為 HTb－IFN－γ，置－80℃保存。

1．2．4 蛋白表達(dá)及SDS－PAGE鑒定 測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒 HTb－IFN－γ 轉(zhuǎn)化至 BL21（DE3）37℃培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶50轉(zhuǎn)接至50 m L LB培養(yǎng)液（含Amp）振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液的OD 600 nm值達(dá)0．4～0．6時(shí)進(jìn)行IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)。以1．0 mmol／L IPTG 37℃誘導(dǎo)8 h，取1 m L菌液離心棄上清，沉淀用100μL PBS重懸，取10μL加上樣緩沖液煮沸10 min后SDS－PAGE電泳，鑒定蛋白表達(dá)情況。

優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)可溶性蛋白的條件，IPTG濃度設(shè)0．1、0．4、0．7、1．0 mmol／L 共4個(gè)梯度，誘導(dǎo)時(shí)間設(shè)4、8、12、24、48 h共5個(gè)梯度，誘導(dǎo)溫度設(shè)23、27、32、37℃共4個(gè)梯度。表達(dá)后取1 m L菌液，離心棄上清，沉淀用100μL PBS重懸，超聲波裂解，程序設(shè)置為超聲4 s間隔8 s，直至菌液澄清 。裂解后12 000 r／min離心10 min，分別取上清和沉淀，加入上樣緩沖液煮沸10 min后各取10μL進(jìn)行SDSPAGE電泳?？捡R斯亮藍(lán)染色，分析表達(dá)蛋白的可溶性。

1．2．5 Western blot分析 誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至NC膜上，50 g／L脫脂奶粉封閉過(guò)夜。用IFN－γ檢測(cè)試劑盒中抗IFN－γ多克隆抗體室溫孵育3 h，PBST（含吐溫5m L／L）洗膜3次后HRP－酶標(biāo)二抗室溫孵育1 h；PBST（含吐溫5 m L／L）洗膜3遍，加入沉淀型TMB避光顯色15 min，沉淀型TMB溶液可與HRP反應(yīng)形成藍(lán)色沉淀，顯色后分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2．1 PCR＋1擴(kuò)增結(jié)果

PCR＋1擴(kuò)增產(chǎn)物的10 g／L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，擴(kuò)增得到560 bp的條帶，與預(yù)期大小相符。將目的基因條帶割膠純化后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，確定獲得基因?yàn)殡uIFN－γ。

2．2 重組質(zhì)粒的鑒定

重組克隆質(zhì)粒p UC－IFN－γ經(jīng)雙酶切和PCR鑒定，均能得到560 bp的條帶（圖2）。重組表達(dá)質(zhì)粒HTb－IFN－γ經(jīng)雙酶切和PCR鑒定，均能得到473 bp的條帶（圖3）。

2．3 表達(dá)產(chǎn)物SDS－PAGE鑒定

SDS－PAGE顯示以1．0 mmol／L IPTG 37℃誘導(dǎo)8 h后，在約21 ku位置出現(xiàn)特異性條帶，與目的條帶大小相符（圖4）。經(jīng)條件優(yōu)化，在0．4 mmol／L IPTG 27℃誘導(dǎo)表達(dá)42 h后其表達(dá)的可溶性蛋白占總蛋白比例最多（圖5）。

2．4 Western blot分析結(jié)果

Western blot顯示在21 ku處有特異性藍(lán)色條帶，表明誘導(dǎo)表達(dá)的IFN－γ可與抗IFN－γ多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)（圖6）。

圖1 IFN－γ的PCR＋1擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 The amplification of IFN－γgene by PCR＋1

圖2 重組克隆質(zhì)粒p UC－IFN－γ的酶切鑒定結(jié)果Fig．2 Identification of recombinant cloned plasmid p UC－IFN－γ by Eco RⅠ＋XbaⅠdigestion

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒HTb－IFN－γ的酶切鑒定結(jié)果Fig．3 Identification of recombinant expression plasmid HTb－IFN－γ by Eco RⅠ＋XbaⅠdigestion

圖4 表達(dá)蛋白的SDS－PAGE分析Fig．4 Analysis of protein expression by SDS－PAGE

3 討論

傳統(tǒng)的PCR技術(shù)具有擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但在擴(kuò)增動(dòng)物基因過(guò)程中對(duì)等位基因的同時(shí)擴(kuò)增，尤其是SNP豐富的多倍體基因，難以避免DNA雙鏈間的錯(cuò)配現(xiàn)象，使得擴(kuò)增得到的基因在后續(xù)的克隆過(guò)程中因宿主菌的隨機(jī)修復(fù)而與原基因出現(xiàn)差異，基因雜合度越高，差異越大，并最終造成測(cè)序圖譜正常，但實(shí)際上該核酸序列并不存在，且能直接導(dǎo)致表達(dá)的蛋白與自然存在差異，從而影響對(duì)該蛋白的功能研究。若直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，對(duì)于雜合基因可以從測(cè)序峰圖上得到套峰，能夠分析出該SNP位點(diǎn)，卻無(wú)法得到每條等位基因的準(zhǔn)確序列。Borriello F等［4］采用PCR＋1技術(shù)擴(kuò)增鼠科蛋白酶抑制蛋白（a1－PI），消除了雜合子等位基因擴(kuò)增后錯(cuò)配基因克隆到載體的機(jī)會(huì)，保證了基因的準(zhǔn)確性。本研究根據(jù)該方法的原理，對(duì)操作步驟進(jìn)行了改進(jìn)：①增多循環(huán)數(shù)以提高體系中模板的數(shù)量，因?yàn)榈?階段的循環(huán)中上游引物的含量只有下游引物的1／10，其擴(kuò)增效率比普通PCR要小得多，增多循環(huán)數(shù)能夠使模板數(shù)量增多，有利于最后1個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增；②Borriello等在第1階段循環(huán)結(jié)束后只取了擴(kuò)增產(chǎn)物的1／4作為模板加入第3條引物進(jìn)行最后一個(gè)循環(huán)，本研究中取第1階段擴(kuò)增的全部產(chǎn)物加入第3條引物，即簡(jiǎn)化操作步驟又能獲得更多的目的基因。通過(guò)該方法，成功獲得了與預(yù)期大小相符的目的條帶，經(jīng)測(cè)序確定為雞IFN－γ基因。PCR＋1方法存在的缺點(diǎn)就是擴(kuò)增效率不如普通的PCR，擴(kuò)增過(guò)程中引物不能得到有效利用的現(xiàn)象。

圖5 表達(dá)蛋白的可溶性分析Fig．5 Solubility analysis of expressied protein

圖6 Western blot分析結(jié)果Fig．6 Analysis result by Western blot

干擾素在1957年最先發(fā)現(xiàn)于禽類。1994年Sekellick M J等［5］首次克隆得到雞IFN－α基因，1995年Digby M R等［6］克隆到雞IFN－γ基因，接著Weining K C等［7］在大腸埃希菌（E．coli）中表達(dá)了雞IFN－γ，并證實(shí)表達(dá)產(chǎn)物具有一定的生物學(xué)活性。此后，雞IFN－γ在疫病預(yù)防和治療的作用逐漸得到重視，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組雞IFN－γ作為免疫佐劑來(lái)提高雞抵抗病毒病、寄生蟲病等疾病的能力成為研究熱點(diǎn)［8］。有研究表明重組干擾素與天然干擾素具有同樣的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)活性［9］，重組雞IFN－γ在作為治療制劑或作為疫苗使用的佐劑呈現(xiàn)一定的效果［10］，如葉秀華等［11］發(fā)現(xiàn)重組雞IFN－γ在體內(nèi)能明顯抵抗球蟲的作用，齊靜等［12］利用犬腎細(xì)胞－水皰性口炎病毒（MDCK－VSV）系統(tǒng)證明天然純化的IFN－γ蛋白具有抗病毒活性，曾巖等［13］發(fā)現(xiàn)重組雞IFN－γ對(duì)H5亞型禽流感滅活苗的免疫增強(qiáng)作用，這些研究結(jié)果證明雞IFN－γ在預(yù)防控制某些疾病中具有良好的應(yīng)用前景。

現(xiàn)已有多種原核和真核表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用于重組蛋白的生產(chǎn)。以大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)為代表具有遺傳背景清楚、成本低、表達(dá)量高和表達(dá)產(chǎn)物分離純化相對(duì)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。然而高水平表達(dá)的蛋白質(zhì)一般缺乏有效的加工機(jī)制，大多以不溶解的包涵體形式存在［14－15］，需要經(jīng)過(guò)繁瑣的變性、純化和復(fù)性的過(guò)程才能得到有活性的蛋白，為重組干擾素的生產(chǎn)增加了困難。因此，提高蛋白可溶性、穩(wěn)定性是優(yōu)化原核表達(dá)的重要方向。首先，選用合適的載體與菌株結(jié)合可明顯提高目的蛋白可溶部分的比例及活性［16］；其次，通過(guò)降低IPTG誘導(dǎo)濃度、降低溫度等條件可降低蛋白表達(dá)的速率，使表達(dá)蛋白有更充分的時(shí)間折疊［17］；第三，通過(guò)引入促溶標(biāo)簽或分子伴侶進(jìn)行融合表達(dá)［18－19］。BL21（DE3）是蛋白酶缺失的宿主菌，非常有利于重組蛋白的表達(dá)，Ignatova Q M等用BL21（DE3）作為重組青霉素酰胺酶的表達(dá)宿主菌，結(jié)果比其他宿主菌的可溶性表達(dá)量高。代麗等［20］選用pProEXTMHTa表達(dá)載體表達(dá)雞IFN－γ，其可溶性蛋白可達(dá)總蛋白的50%且具有抗NDV活性。因此，本研究選用pProEXTMHTb表達(dá)載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并通過(guò)設(shè)立誘導(dǎo)溫度梯度、IPTG濃度梯度以及誘導(dǎo)時(shí)間來(lái)優(yōu)化可溶性蛋白表達(dá)條件。p ProEXTMHTb有His標(biāo)簽可通過(guò)鎳柱進(jìn)行純化，同時(shí)，在設(shè)計(jì)引物IFNG－F2時(shí)插入腸激酶識(shí)別位點(diǎn)，可在純化后通過(guò)腸激酶將重組蛋白切割掉His標(biāo)簽和腸激酶識(shí)別位點(diǎn)，最大程度上保證蛋白的正確性，為制備抗IFN－γ單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and Prokaryotic Expression of IFN－γGene of Red Jungle Fowl

SUN Ting－ting，MA Zhi－liang，JI Bin，HU Wen－li，CHEN Pei－fu

（CollegeofAnimalScienceandTechnology，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming，Yunnan，605201，China）

A method which permitted the selective cloning of homoduplex of molecules was used to clone the IFN－γcomplete gene from PBMC induced by Con A．The PCR＋1 products were ligated with p UC18 vector and the mature peptide gene was amplified．The recombinant expression plasmid named HTb－IFN－γ was constructed and induced with IPTG inE．coliBL21（DE3）．The expression products were analyzed by SDS－PAGE and Western blot．The results showed that a fragment containing 560 bp was amplified by PCR＋1 and mature peptide gene containing 473 bp was obtained from positive plasmid p UC－IFN－γ．SDSPAGE and Western blot analysis indicated that induced with IPTG inE．coliBL21（DE3），IFN－γwas expressed with the size about 21 ku and could be combined with polyclonal antibody against IFN－γwhich made clear that the products had immunological reactive activity．

red jungle fowl；interferon－γ；asymmetric PCR；prokaryotic expression

S852．43；Q786

A

1007－5038（2014）07－0047－05

2013－12－06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31060130）

孫亭亭（1983－），女，山東濱州人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)研究。＊ 通訊作者