羅非魚hepcidin 1－5成熟肽在畢赤酵母中的表達(dá)和活性研究＊

梁 盈，梁 瑞，張永安，祁克宗，涂 健，彭開松 ，＊

（1．安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥230036；2．中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430072）

羅非魚hepcidin 1－5成熟肽在畢赤酵母中的表達(dá)和活性研究＊

梁 盈1，梁 瑞1，張永安2，祁克宗1，涂 健1，彭開松1，2＊

（1．安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥230036；2．中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430072）

為獲得重組酵母分泌表達(dá)的莫桑比克羅非魚hepcidin并進(jìn)行其功能研究，將羅非魚hepcidin 1－5（TH1－5）成熟肽c DNA插入表達(dá)載體pPIC9K，獲得重組分泌表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K－TH1－5，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，陽性克隆經(jīng)甲醇誘導(dǎo)獲得表達(dá)上清；表達(dá)上清凍干品經(jīng)Dot－ELISA檢測，并分析了表達(dá)產(chǎn)物對指示菌和雞外周血淋巴細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，TH1－5成熟肽可通過表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)分泌型表達(dá)，Dot－ELISA檢測表達(dá)上清中含有TH1－5。重組表達(dá)的TH1－5對大腸埃希菌（CMCC44102）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、糞腸球菌（ATCC29212）具有明顯的抑菌活性；含重組表達(dá) TH1－5的上清凍干品（6．25 mg／m L）可協(xié)同Con A（0．125μg／m L）或LPS（0．125μg／m L）促進(jìn)雞外周血淋巴細(xì)胞的增殖。

羅非魚hepcidin；酵母表達(dá)；斑點(diǎn)－酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；抑菌活性；淋巴細(xì)胞增殖

羅非魚是聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO）推廣的世界性養(yǎng)殖品種，其對世界水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要性僅次于鯉科魚類和鮭鱒魚類。中國是世界上羅非魚產(chǎn)量最大的國家，羅非魚也是我國出口量最大的淡水養(yǎng)殖品種。但近年來，水產(chǎn)動物的細(xì)菌性疾病引起的損失慘重，雖然抗菌藥物是目前的主要防治手段，但容易產(chǎn)生耐藥性和導(dǎo)致組織中抗菌藥物殘留，給食品安全埋下隱患，并影響水產(chǎn)品出口［1］。因此，很有必要尋找新的抗生素替代品?？咕氖且活悘V泛存在于生物體的內(nèi)源性小肽，其獨(dú)特的作用機(jī)制使得微生物不容易產(chǎn)生抗藥性，是備受關(guān)注的抗生素替代品。抗微生物肽除了具有抗菌、抗囊膜病毒、抗腫瘤、抗真菌等天然免疫活性外，還具有趨化、免疫調(diào)節(jié)等功能［2］。自2000年hepcidin被發(fā)現(xiàn)以來就成為研究最為活躍的抗微生物肽類群，hepcidin主要在肝臟表達(dá)，但在其他組織和體液中也有廣泛的分布。hepcidin含有8個半胱氨酸，通過二硫鍵形成穩(wěn)定的β折疊，這種結(jié)構(gòu)可以通過成孔作用增加細(xì)胞膜的通透性，阻斷呼吸鏈，殺傷病原微生物［3］。莫桑比克羅非魚有3種hepcidin，人工合成的羅非魚hepcidin具有抗菌、抗病毒和抗腫瘤活性［4－6］；而轉(zhuǎn)羅非魚hepcidin基因的蝦和魚對水產(chǎn)動物病原菌抵抗能力增強(qiáng)［7－8］。至于基因工程表達(dá)的羅非魚hepcidin及其功能，還未見報道。本文擬采用酵母分泌型表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)羅非魚hepcidin 1－5，建立檢測hepcidin的Dot－ELISA方法，并檢測其對常見病原菌的抗菌活性及其對雞外周血淋巴細(xì)胞增殖的效應(yīng)，期望能為新型綠色抗生素替代品的研發(fā)提供借鑒。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株和質(zhì)粒 酵母表達(dá)質(zhì)粒p PIC9K和畢赤酵母GS115，為Invitroge公司產(chǎn)品；大腸埃希菌DH5α、大腸埃希菌（CMCC44102）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）和糞腸球菌（ATCC29212），均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1．1．2 主要試劑和培養(yǎng)基 限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ和BglⅡ?yàn)镕rement公司產(chǎn)品；T4 DNA Ligase和培養(yǎng)基為BBI公司產(chǎn)品；Premix ExTaqTMVersion 2．0為天根生化科技（北京）生物有限公司產(chǎn)品；小牛腸堿性磷酸酶（CIAP）和DL 2 000等為Ta KaRa公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和DAB顯色試劑盒等為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；LPS和Con A為Sigma公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純；羅非魚hepcidin 1－5（GIKCRFCCGCCTPGICGVCCRF，純度95%）和KLH偶聯(lián)的hepcidin 1－5為上海強(qiáng)耀生物科技有限公司產(chǎn)品；兔抗羅非魚hepcidin 1－5抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備；淋巴細(xì)胞分離液（聚蔗糖－泛影葡胺，ρ＝1．077 g／m L±0．001 g／m L）為Solarbio公司產(chǎn)品；胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；YPD、MD、MM、BMGY、BMMY 等均按Invitrogen畢赤酵母表達(dá)操作手冊配方配制。

1．2 方法

1．2．1 TH1－5成熟肽基因合成 參考報道的TH1－5成熟肽基因序列［9］，按畢赤酵母GS115偏愛密碼子進(jìn)行優(yōu)化［10］，并在兩端加上EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列如下：GAATTCGGTATCAAGTGTAGATTCTGCTGTGGTTGCTGCACCCCAGGTATCTGTGGAGTTTGCTGCAGATTCTAA GCGGCCGC（下劃線部分分別為EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)），并將其克隆到 PUC57－DNA－simple載體上，構(gòu)建克隆載體PUC57－DNA－simple－TH1－5。

1．2．2 pPIC9K－TH1－5成熟肽重組質(zhì)粒的構(gòu)建分別用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切p PIC9K和PUC57－DNA－simple－TH1－5，回 收 目 標(biāo) 片 段，并 在T4 DNA Ligase作用下16℃連接12 h，連接產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)E．coliDH5α，并涂布于含 Amp（100μg／m L）的LB平板上，篩選陽性單菌落，抽提質(zhì)粒。以 5′AOX1（5′－GACTGGTTCCAATTGACAAGC－3′）、3′AOX1（5′－GCAAATGGCATTCTGACATCC－3′）為引物，進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)條件為：94℃4 min；94℃30 s，50℃30 s，72℃30 s，共25個循環(huán)；68℃10 min。將篩選得的陽性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。

1．2．3 p PIC9K－TH1－5電轉(zhuǎn)化畢赤酵母 GS115將重組表達(dá)質(zhì)粒p PIC9K－TH1－5用SacⅠ酶切線性化后，回收目的片段。電擊法轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母GS115。1 500 r／min離心轉(zhuǎn)化液3 min，棄大部分上清，留100μL重懸沉淀后涂于不含組氨酸的MD平板，30℃培養(yǎng)2 d。從MD平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種YPD培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，無菌條件下取1 m L菌液，3 000 r／min離心3 min，收集沉淀重懸于500μL的PBS（p H 7．4）；3 000 r／min離心3 min，收集沉淀重懸于100μL的 TE，沸水煮10 min，在－80℃冷凍30 min后再次煮沸10 min，3 000 r／min離心5 min。取離心后上清3μL為模板，以5′AOX1、3′AOX1為引物用PCR法篩選和鑒定陽性重組酵母轉(zhuǎn)化子，并測序驗(yàn)證。同時將BglⅡ線性化的pPIC9K空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母，挑選出pPIC9K轉(zhuǎn)化GS115菌株作為空白對照。

1．2．4 重組酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)表達(dá) 將p PIC9KTH1－5和空載體p PIC9K轉(zhuǎn)化成功的陽性轉(zhuǎn)化子接種到100 m L的BMGY中，26℃～28℃，250 r／min搖床培養(yǎng)至OD 600 nm＝2．0～6．0，4℃靜置2 h～4 h后棄上清收集沉淀，重懸于50 m L的BMMY，28℃搖床培養(yǎng)96 h，每隔24 h按終濃度5 m L／L添加甲醇。收集表達(dá)上清冷凍干燥后，置－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．5 Dot ELISA方法的建立

1．2．5．1 兔抗TH1－5血清的制備 取人工合成的TH1－5－KLH蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化均勻后免疫接種健康雄性家兔（體重2 kg），首免后隔2周用TH1－5－KLH蛋白與等體積弗氏不完全佐劑乳化均勻后加強(qiáng)免疫1次，再隔3周加強(qiáng)免疫1次，3免后14 d，心臟采血獲得 TH1－5血清［11］。

1．2．5．2 Dot－ELISA 檢測重組 TH1－5 試驗(yàn)共設(shè)計(jì)8組，其中第2組為陽性對照組，3組～8組為陰性對照組。待檢樣品包括pPIC9K－TH1－5表達(dá)上清凍干粉（100 mg／m L）、空載體表達(dá)上清凍干粉（100 mg／m L）和 TH1－5合成肽（100μg／m L），取待檢樣品各1．5μL，點(diǎn)在各對應(yīng)組的硝酸纖維素膜光面壓印圈的中央，其中完全空白對照組（第8組）不做任何處理，顯示硝酸纖維素膜光面壓印圈本來底色，置4℃冰箱過夜。將膜置于20 g／L BSA（p H 7．4，0．01 mol／L的PBS配置）中37℃搖床封閉30 min～60 min。自然干燥后，將膜片（第1、2、3、6組）浸入到1∶50（含20 g／L BSA的PBST溶液稀釋）的一抗（兔抗TH1－5血清）中37℃孵育2 h；第4組（陰性血清對照）浸入到不含TH1－5抗體的未免血清中；第5（空白一抗）和7組（空白一二抗）用PBS代替一抗。自然干燥后，按同樣方法封閉膜30 min～60 min。然后將第1、2、3、4、5組的膜片置于1∶200稀釋的酶標(biāo)二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG）中，37℃孵育1 h；第6和7組膜片用PBS代替二抗。將膜片放入洗滌液（含20 g／L BSA的PBST）中振蕩洗滌4次，每次3 min～5 min。晾干后，在避光條件下，每個壓印圈內(nèi)點(diǎn)1．5μL的DAB顯色液，避光顯色10 min，去離子水沖洗3次終止反應(yīng)，自然干燥后判定結(jié)果。陽性結(jié)果為棕黃色顆粒。

1．2．6 表達(dá)上清抑菌活性檢測 以大腸埃希菌（CMCC44102）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）、糞腸球菌（ATCC29212）為指示菌，分別取過夜培養(yǎng)的指示菌用滅菌蒸餾水稀釋1 000倍后，取100μL均勻涂布于含LB固體培養(yǎng)基20 m L直徑為9 cm，厚度為3 mm的平板。將冷凍干燥的表達(dá)產(chǎn)物用滅菌蒸餾水配置成濃度為1 g／m L的待檢樣品，0．22μm濾膜除菌，分別點(diǎn)接pPIC9K－TH1－5／GS115表達(dá)上清濃縮液、pPIC9K／GS115表達(dá)上清濃縮液（陰性對照）和卡那霉素（100μg／m L）到直徑7 mm 的瓊脂孔，30μL／孔，37℃培養(yǎng)過夜，觀察抑菌圈。

1．2．7 重組表達(dá)TH1－5對淋巴細(xì)胞增值的影響

按說明書推薦程序分離雞外周血淋巴細(xì)胞，用完全RPM Ⅰ1640培養(yǎng)液（含100 m L／L胎牛血清和10 m L／L三抗）稀釋淋巴細(xì)胞濃度到約為106cell／m L，按試驗(yàn)?zāi)康膶⒓?xì)胞加入96孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（40℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度）平衡2 h后加入對應(yīng)測試物，其中LPS與TH1－5共刺激組、Con A與TH1－5共刺激組同時加入2種刺激物。將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，所有孔加入MTT溶液10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入100 g／L SDS－0．01 mol／L HCl溶液100μL，置培養(yǎng)箱反應(yīng)過夜（溶解時間不超過18 h）后測定OD 570 nm值。所用試驗(yàn)設(shè)6個重復(fù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，用 MINITAB release 10．1 package（Minitab Inc．USA）軟件計(jì)算。單因素差異性分析用ANOVA Procedure from SAS Software Release 8．1（SAS Institute Inc．，Cary，NC，USA）軟件分析。

2 結(jié)果

2．1 TH1－5成熟肽基因在畢赤酵母中的表達(dá)

2．1．1 p PIC9K－TH1－5重組質(zhì)粒的鑒定 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳顯示，連接成功的重組表達(dá)質(zhì)粒比空載體（p PIC9K）大（圖1）。測序結(jié)果顯示，構(gòu)建的重組酵母表達(dá)質(zhì)粒的堿基序列與預(yù)期完全相同，表明重組表達(dá)質(zhì)粒p PIC9K－TH1－5構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig．1 Identification of recombinant plasmid pPIC9K－TH1－5 by PCR

2．1．2 陽性酵母菌株的鑒定 挑取電轉(zhuǎn)化成功的酵母菌株，提取基因組，以5′AOX1、3′AOX1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，結(jié)果顯示陽性重組子基因組（pPIC9K－TH1－5／GS115）為模板可擴(kuò)增出2 200 bp和556 bp的條帶，而以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌基因組（pPIC9K／GS115）為模板可擴(kuò)增出 2 200 bp 和493 bp的條帶（圖2），PCR結(jié)果與預(yù)期大小一致，測序結(jié)果證明重組質(zhì)粒已經(jīng)成功同源重組整合到GS115。從泳道1的PCR產(chǎn)物可知轉(zhuǎn)化子為mut＋表型。

圖2 重組酵母的PCR鑒定Fig．2 Identification of recombinant Pichia pastoris GS115 by PCR

2．2 重組酵母菌株表達(dá)上清的檢測

用建立的 Dot－ELISA法檢測陽性重組子（p PIC9K－TH1－5／GS115）的表達(dá)上清（圖 3 中第1組）和人工合成TH1－5（陽性對照，圖3中第2組）有清晰的棕黃色斑點(diǎn)，而含pPIC9K空質(zhì)粒的GS115表達(dá)上清（圖3中第3組）和其他陰性對照（圖3中第4組～第7組）均無顯色，這表明建立的Dot－ELISA法可成功檢測重組表達(dá)的TH1－5。

圖3 重組酵母誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的Dot－ELISA分析Fig．3 Dot－ELISA analysis of inducible expressed products of recombinant Pichiapastoris

2．3 重組表達(dá)產(chǎn)物TH1－5抗菌活性的檢測

p PIC9K－TH1－5／GS115誘導(dǎo)表達(dá)的上清為待檢樣品，以空質(zhì)粒酵母菌株p PIC9K／GS115誘導(dǎo)表達(dá)的上清作為陰性對照，以卡那霉素為陽性對照。經(jīng)畢赤酵母分泌表達(dá)的TH1－5對大腸埃希菌（CMCC44102）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）和糞腸球菌（ATCC29212）均有不同程度的抑菌作用（圖4中1號孔）。而含空載體的pPIC9K／GS115的表達(dá)上清對4種指示菌均無抑菌作用（圖4中2號孔）。

圖4 表達(dá)上清抑菌活性的檢測Fig．4 Bacteriostatic activity detection of expressed supernatant

2．4 重組表達(dá)的TH1－5對淋巴細(xì)胞增殖的影響

由表1可知，6．25 mg／m L的重組表達(dá) TH1－5粗制品雖然對雞外周血淋巴細(xì)胞增殖無顯著影響，但重組表達(dá) TH1－5粗制品（6．25 mg／m L）與 Con A（0．125μg／m L）共刺激雞外周血淋巴細(xì)胞時，具有協(xié)同促進(jìn)增殖效應(yīng)。由表2可知，重組表達(dá)TH1－5粗制品（6．25 mg／m L）雖然對雞外周血淋巴細(xì)胞增殖無顯著影響，但其與LPS（0．125μg／m L）共刺激雞外周血淋巴細(xì)胞時，具有協(xié)同促進(jìn)增殖效應(yīng)。

表1 重組表達(dá)的TH1－5粗制品與Con A共刺激對雞外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effect of recombinant expressed crude TH1－5 and Con A on proliferation of peripheral blood lymphocytes

3 討論

內(nèi)源性抗菌肽是比較理想的抗生素替代品，有望用于動物生產(chǎn)，特別是水產(chǎn)養(yǎng)殖。但要獲得大量用于生產(chǎn)的抗菌肽產(chǎn)品，通過基因工程重組表達(dá)應(yīng)該是比較可行的途徑。已有大量研究顯示，基因工程重組表達(dá)的抗菌肽與人工合成的抗菌肽或生化純化的天然抗菌肽具有相同或相似的抗菌活性［12］。由于抗菌肽對原核宿主菌（如大腸埃希菌和乳酸菌）通常具有很強(qiáng)的殺傷作用，一般采用原核融合表達(dá)［12］或在酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)［13］；而原核融合表達(dá)產(chǎn)物由于含有標(biāo)簽使得表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量變大，雖然有些研究顯示攜帶融合標(biāo)簽的抗微生物肽的抗菌活性并沒有受到影響［12］，但原核融合表達(dá)后下游加工過程復(fù)雜。因此，畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)是比較理想的選擇，其表達(dá)上清中含有重組抗菌肽可以直接使用或添加載體制成飼料添加劑使用。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是比較成熟的表達(dá)系統(tǒng)，已經(jīng)用于表達(dá)多種類型的抗菌肽，包括富含半胱氨酸的抗菌肽（如hepcidin和defensin）和不含半胱氨酸的抗菌肽（如cathelicidin）等［14－18］。這些抗菌肽來源于包括哺乳類、鳥類、魚類、甲殼類等。目前，包括大菱鲆、大黃魚、石斑魚在內(nèi)的多種魚類的hepcidin已經(jīng)成功地在畢赤酵母獲得表達(dá)［14－18］，并對待檢菌具有不同程度的抗菌活性。但還未見羅非魚hepcidin在畢赤酵母成功表達(dá)的報道。本研究通過酵母密碼子優(yōu)化后表達(dá)的TH1－5對大腸埃希菌（CMCC44102）、金黃色葡萄球菌（ATCC25923）、銅綠假單胞菌（ATCC27853）和糞腸球菌（ATCC29212）均有不同程度的抑菌作用，這與報道的類似研究結(jié)果一致。

表2 重組表達(dá)的TH1－5粗制品與LPS共刺激對雞外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響Table 2 Effect of recombinant expressed crude TH1－5 and LPS on proliferation of peripheral blood lymphocytes

基因工程表達(dá)抗菌肽的檢測，主要是通過Tricine－SDS－PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物［19］，通過分子質(zhì)量是否與預(yù)期相同來初步判斷抗菌肽是否表達(dá)，但由于抗菌肽分子質(zhì)量小（分子質(zhì)量小于10 ku）或由于表達(dá)產(chǎn)物中濃度太低，不容易被檢測到；此外，由于表達(dá)標(biāo)簽的存在或表達(dá)的肽分泌時切割不完全或表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)致的表達(dá)產(chǎn)物N端氨基酸增加等，也會導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量可能與預(yù)期并不完全一致。以抗體為基礎(chǔ)的檢測重組表達(dá)抗菌肽方法主要為蛋白質(zhì)印跡［20］，但該方法需要專業(yè)化設(shè)備和較長試驗(yàn)時間。本研究建立的Dot－ELISA法能用于檢測表達(dá)的TH1－5，具有所需設(shè)備簡單和快速等特點(diǎn)［21］，可為基因工程表達(dá)抗菌肽的檢測提供方法借鑒。

重組表達(dá)的抗菌肽的功能評價，大多僅限于抗菌活性的評價，關(guān)于抗菌肽對免疫調(diào)節(jié)活性的評價少有報道。人淋巴細(xì)胞的正常增殖可能需要Hepcidin參與［22］。雖然本研究顯示重組表達(dá)TH1－5粗制品（6．25 mg／m L）對雞外周血淋巴細(xì)胞增殖無作用，但 能 協(xié) 同 LPS （0．125μg／m L）或 Con A（0．125μg／m L）刺激外周血中的B細(xì)胞或T細(xì)胞增殖，表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)作用，這與同樣具有多半胱氨酸的β－defesin 類 似［23－24］。此外，本 實(shí)驗(yàn)室研 究 顯 示TH1－5協(xié)同LPS或Con A刺激淋巴細(xì)胞增殖作用呈現(xiàn)劑量依賴性（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。同時，本研究結(jié)果還表明魚類hepcidin對雞淋巴細(xì)胞增殖有活性，提示hepcidin對淋巴細(xì)胞增殖活性的影響可跨種屬發(fā)揮作用。因此，hepcidin不僅具有天然免疫活性，而且還可能參與對獲得性免疫的調(diào)節(jié)作用。

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Expression of TH1－5 Mature Peptide inPichiapastorisand Analysis of Its Biological Activites

LIANG Ying1，LIANG Rui1，ZHANG Yong－an2，QI Ke－zong1，TU Jian1，PENG Kai－song1，2
（1．CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei，Anhui，230036，China；2．StateKeyLaboratory ofFreshwaterEcology＆Biotechnology，InstituteofHydrobiology，ChineseAcademyofSciences，Wuhan，Hubei，430072，China）

To obtain the expressing recombinant hepcidin1－5 ofOreochromismossambicus（TH1－5）byPichiapastorisand study their function，the recombinant expression vector pPIC9K－TH1－5 were constructed，and then transformed intoP．pastorisGS115 by electroporation．The recombinant TH1－5 was expressed in the positive clones of recombinant GS115 under the induction of methanol．The expressed supernatant was detected by Dot ELISA，and antibacterial activity and the effect of proliferation of peripheral blood lymphocyte were analysis．The results showed that the recombinant TH1－5 was expressed by vector p PIC9K in the supernatant ofPichiapastorisGS115，and could be detected by Dot ELISA．Recombinant expressed TH1－5 demonstrated obvious antibacterial activities toEscherichiacoli（CMCC44102），Stapylococcusaureus（ATCC25923），Pseudomonasaeruginosa（ATCC27853）andEnterococcusfaecalis（ATCC29212）．The lyophilized supernatant of recombinant expressed TH1－5 in concentration of 6．25 mg／m L can synergistically promote the proliferation of chicken peripheral blood lymphocytes with LPS（0．125 μg／m L）or Con A（0．125μg／m L）．

Oreochromismossambicushepcidin；expression inPichiapastoris；Dot ELISA；antibacterial activity；lymphocyte proliferation．

R979．5

A

1007－5038（2014）07－0038－06

2013－12－06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30800811）；國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2014CB138600）；安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)

與穩(wěn)定人才基金項(xiàng)目（yj2006－13）

梁 盈（1988－），女，河南孟州人，碩士，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。＊ 通訊作者