與自身免疫T1D 相關的控制iNKT 細胞發(fā)育的基因

李 莉 李惠英 鐘海燕 樊 茂 劉曉寧 (云南省昆明市兒童醫(yī)院，昆明 650000)

iNKT 細胞(invariant Natural killer T cells，iNKT cells)，半恒定自然殺傷T 細胞，是一群能夠調控機體抗病毒、細菌、真菌、寄生蟲、腫瘤、同種異體移植物以及自身組織免疫反應的免疫調節(jié)性T 細胞［1，2］。與傳統(tǒng)T 細胞相比，iNKT 細胞不僅具有CD1d 限制性，而且可以同時表達NK 細胞表面標志CD161(人類)(鼠類NK1.1)以及恒定的Vα24-Jα18/Vβ11 T 細胞受體(TCR)(人類)(鼠類Vα14-Jα18/Vβ8.2、7、2 TCR)。iNKT 細胞可通過其表面TCR 與抗原遞呈細胞表面的MHC Ⅰ樣分子——CD1d 遞呈的糖脂質抗原結合而激活，活化后快速產(chǎn)生大量的細胞因子，調節(jié)天然免疫和適應性免疫應答［3］。1 型糖尿病(Type 1 diabetes，T1D)是器官特異性的自身免疫反應性疾?。?］。近年來大多數(shù)研究表明，iNKT 細胞數(shù)量減少、功能缺失與自身免疫T1D 的發(fā)生密切相關［5，6］。雖然目前對于iNKT細胞減少引發(fā)自身免疫T1D 的作用機制尚不清楚，但新近發(fā)現(xiàn)的一些參與調控iNKT 細胞發(fā)育以及參與iNKT 細胞調控T1D 的相關基因、信號分子將可能成為評價人類自身免疫T1D 發(fā)生風險的關鍵指標［7，8］。因此，本文將對這些相關基因、信號分子在控制NKT 細胞發(fā)育以及與T1D 發(fā)病之間的聯(lián)系展開綜述。

1 控制NKT 細胞表達的相關基因座位——Nkt1、Nkt2、Idd

非肥胖型糖尿病小鼠(NOD 小鼠)是多種自身免疫性疾病(Autoimmunity disease，AID)的易感動物，包括T1D、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)、實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis)等。目前已證明，NOD 小鼠胸腺、肝臟、脾臟中的NKT 細胞數(shù)量遠遠低于其他常見種系小鼠，而且其NKT 細胞產(chǎn)生IL-4 的量也相對較低，相比C57BL/6 小鼠低將近20 倍［9-11］。

有研究通過比對NOD 小鼠與C57BL/6 小鼠的基因圖譜，篩選出了與NKT 細胞數(shù)量具有重要聯(lián)系的兩個基因座位:即C57BL/6 小鼠1 號染色體上的Nkt1 座位和2 號染色體上的Nkt2 座位，這兩個基因座位分別與NOD 狼瘡小鼠1 號染色體遠端的易感基因Babs2/Bana3 以及NOD 糖尿病小鼠2 號染色體上的易感基因Idd13 相對應［12-14］。這說明NOD小鼠AID 的發(fā)生與這兩個基因座位的缺陷具有很大的關系，而正因為缺乏這些基因座位的表達，才使得其體內(nèi)的NKT 細胞數(shù)量極少、功能缺失、并導致機體內(nèi)T1D、SLE 等AID 的發(fā)生。

有研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6 小鼠殺傷細胞的凝集素樣受體亞家族B(Klrb)Ⅱ型跨膜蛋白C 型凝集素受體中的兩個受體(Klrb1c/NKR-P1C、Klrb1b/NKRP1B)均可與NK1.1 抗體-PK136 反應，而NOD 小鼠體內(nèi)的淋巴細胞卻并不能與之反應，這說明C57BL/6 小鼠淋巴細胞內(nèi)含有可以表達NK1.1(即具有Klrb1c/ NKR-P1C 及Klrb1b/ NKR-P1B)的自然殺傷細胞(Natural killer cells，NK cells)以及NKT 細胞，而在NOD 小鼠淋巴細胞中卻缺少這些細胞。因此，為了使NOD 小鼠體內(nèi)也可產(chǎn)生具有表達NK1.1特性的殺傷細胞，研究者通過回交雜種的方式，首先將親本代C57BL/6 小鼠與NOD 小鼠進行雜交，產(chǎn)生了子代共基因NOD Nkrp1b 系小鼠(既可表達NK1.1，又攜帶有C57BL/6 等位基因Klrb1c);而后又將其與父母代C57BL/6 小鼠回交，回交至少10代后產(chǎn)生的子代NOD 小鼠，因具有父母代C57BL/6小鼠更多的遺傳背景(C57BL/6 小鼠可表達Nkt1b、Nkt2b)，才 被 稱 為 NOD.Nkrp1b Nkt1 小 鼠 或NOD.Nkrp1b Nkt2 小鼠［12-15］。

Jordan 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，與NOD.Nkrp1b 小鼠相比，NOD.Nkrp1b Nkt1 小鼠胸腺和脾臟內(nèi)NKT 細胞數(shù)量表達增加。這說明通過與C57BL/6 小鼠雜交、回交，NOD 小鼠體內(nèi)獲得了更多的C57BL/6 Nkt1座位，該基因的表達修復了NOD 小鼠體內(nèi)NKT 細胞缺失的功能。然而，值得一提的是，NOD.Nkrp1b Nkt1 小鼠體內(nèi)的NKT 細胞數(shù)量雖然增高了，但卻并不能防止T1D 的發(fā)生，這可能與小鼠體內(nèi)增加的NKT 細胞未成熟有關。

Fletcher 等［16］發(fā)現(xiàn)，與NOD.Nkrp1b 小鼠相比，NOD.Nkrp1b Nkt2 小鼠可以產(chǎn)生更多的胸腺NKT細胞亞群，并能減少T1D 的發(fā)生幾率。通過采用微陣列技術對NOD.Nkrp1b Nkt2 小鼠和NOD.Nkrp1b小鼠的胸腺細胞進行基因表達分析，F(xiàn)letcher 等鑒別出了控制NKT 細胞數(shù)量的潛在基因——過氧化物酶膜蛋白編碼基因Pxmp4，而過氧化物酶在糖脂代謝過程中是很重要的。而且Pxmp4 還綁定于伴侶/膜運輸分子Pex19，而Pex19 又是在Nkt1 連鎖區(qū)域被編碼的。這些相關的證據(jù)表明Nkt1、Nkt2 在NKT細胞的表達過程中可能具有非常重要的調控作用。

此外，胰島素依賴性糖尿病(Insulin-dependent diabetes，Idd)基因，作為與T1D 發(fā)生密切相關的易感基因，在控制NKT 數(shù)量表達的過程中，其也可能參與其中［17］。Jordan 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，C57BL/6 小鼠2 號染色體上的Nkt2 基因座位與NOD 糖尿病小鼠2 號染色體上的易感基因Idd13 相對應。目前發(fā)現(xiàn)至少有兩個基因位點與Idd13 有關，其中一個是β2m(編碼β2-微球蛋白)，而NKT 細胞TCR 識別的CD1d 又是β2m 依賴的膜整合糖蛋白［16，17］，這說明這些基因位點的表達與否很可能與NKT 細胞的活化程度有關。另外，Ueno 等［18］還報道稱，在Idd9.1基因座位表達的T1D 易感基因產(chǎn)物可能在致病機制中起著關鍵的作用。

綜上所述，Nkt1、Nkt2 及Idd 基因的表達與NKT細胞數(shù)量的控制密切相關，并且這種控制將對NKT細胞減少或功能缺失誘導的AID 的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。

2 調控NKT 細胞發(fā)育的相關信號分子——SLAM、SAP、Slamf1、Slamf6

近期研究發(fā)現(xiàn)，淋巴細胞信號活化分子(Signaling lymphocytic activation molecule，SLAM)、SLAM 相關蛋白(SLAM associated protein，SAP)以及SLAM-SAP 信號通路的活化在NKT 細胞的發(fā)育過程中是必不可少的關鍵因素［19，20］。SAP 表達于T細胞、NK 細胞表面、并綁定于SLAM 家族受體的細胞質部分、通過招募Fyn、介導細胞內(nèi)信號通路的活化，而調控胸腺NKT 細胞的發(fā)育。動物模型研究表明，SAP 介導信號通路的活化程度與自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關，因此其被認為是導致人體病理發(fā)生的重要因素［21］。

Jordan 等［12］通過微陣列技術分別 對NOD.Nkrp1b Nkt1 小鼠以及NOD.Nkrp1b 小鼠進行了基因表達分析，結果發(fā)現(xiàn):Slamf1 和Slamf6(分別編碼SLAM 和ly108)很可能是調控Nkt1 表達、并控制NKT 細胞數(shù)量產(chǎn)生多少的最主要基因。因為Slamf1 編碼的受體分子SLAM 可與SAP 結合、活化SAP 信號，而SLAM-SAP 信號又是NKT 細胞發(fā)育過程中必不可少的信號通路，有研究證實在SAP 缺失或其下游Src 激酶Fyn 缺失的小鼠體內(nèi)NKT 細胞嚴重缺陷［22-24］。

流式細胞檢測結果也證實:與NOD.Nkrp1b 小鼠相比，NOD.Nkrp1b Nkt1 小鼠胸腺細胞表面的、Slamf1 編碼的免疫球蛋白樣受體SLAM 的表達水平呈顯著上升。這歸根結底還在于野生型NOD 小鼠的胸腺細胞發(fā)育時，其表面的SLAM 表達存在異常。因此，即便子代NOD.Nkrp1b 小鼠已開始遺傳C57BL/6 小鼠殺傷細胞的特性，但未經(jīng)過多次回交，其胸腺NKT 細胞表面的SLAM 表達還是相對較低的［25］。除此之外，Jordan 等［12］還研究證實:C57BL/6 和NOD.Nkrp1b Nkt1 小鼠體內(nèi)的雙陽性胸腺細胞表面的SLAM 表達水平已達到了峰值，而在成熟的單陽性細胞中其表達水平相對降低;與之相反的是，在NOD.Nkrp1b 小鼠體內(nèi)，單陽性胸腺細胞亞群表面表達的SLAM 最高，而在雙陽性細胞內(nèi)SLAM表達卻相對較低。這說明SLAM 在胸腺中的表達高低直接關系到NKT 細胞的發(fā)育速度，即SLAM 表達增高，將促進雙陽性NKT 細胞(未成熟)在胸腺中的發(fā)育，反之，雙陽性NKT 細胞發(fā)育將受到阻滯。對于上述研究發(fā)現(xiàn)的SLAM 在C57BL/6 小鼠胸腺細胞的表達模式，同樣得到另一研究結論的支持，該研究顯示Slamf1 和Slamf6 基因在雙陽性胸腺細胞內(nèi)的表達接近了峰值，而在單陽性細胞內(nèi)兩者表達水平下降。由此可見，等位基因的變異對于雙陽性胸腺細胞表面SLAM 的表達水平是影響很大的，而這也直接關系到NKT 細胞的發(fā)育過程。雙陽性胸腺細胞表面SLAM的表達下降，使得在NKT 細胞發(fā)育過程中，SLAMSLAM 同型連接功能降低，接著SAP 信號減弱，最終導致NKT 細胞發(fā)育阻滯，這也可能就是NOD 小鼠體內(nèi)NKT 細胞缺陷的原因［25］。

SLAM 表達缺陷除可導致上述NKT 細胞發(fā)育阻滯外，還可導致NOD 小鼠NKT 細胞功能失活。例如，有研究發(fā)現(xiàn)當髓樣樹突狀細胞和NKT 細胞系之間的SLAM-SLAM 連接被蛋白肽鍵阻斷后，Th2 型細胞因子(IL-4/IL-10)會應激產(chǎn)生選擇性修復［25］。

Slamf6 是與Slamf1 緊密連接的、可能影響NKT1 效 應 的 潛 在 基 因［12，22］。有 學 者 將 骨 髓 和Slamf1/Slamf6 雙突變體的嵌合體混合，研究Slamf1和Slamf6 的表達對NKT 細胞發(fā)育的影響，結果證明Slamf6 也參與了NKT 細胞的發(fā)育。該研究首先將Ja18-/-小鼠經(jīng)放射線照射后，接著將CD45 標記的野生型小鼠骨髓和Slamf1 及Slamf6 缺失的嵌合體小鼠骨髓分別與經(jīng)放射線照射后的Ja18-/-小鼠骨髓以1 ∶1比例混合，然后將混合后的骨髓再分別導入經(jīng)放射線照射的Ja18-/-小鼠體內(nèi)、重建免疫功能，結果發(fā)現(xiàn)Slamf1 和Slamf6 缺失的細胞不能刺激產(chǎn)生與野生型相同數(shù)目的NKT 細胞，而且表達嵌合體的小鼠也因Slamf1 和Slamf6 的缺失導致在陽性選擇后NKT細胞的正常增殖分化功能受到破壞［25］。

由此可見，SLAM、SAP、Slamf1、Slamf6 在調控NKT 細胞表達方面發(fā)揮著非常重要的作用。通過收集并借鑒研究這些基因、分子的表達信息，將為后期深入研究NKT 細胞減少誘導AID 發(fā)生的相關分子機制提供有力的證據(jù)，有望在未來將NKT 細胞應用于臨床治療指明新方向。

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