厭氧菌在腫瘤生物治療中的研究進(jìn)展

黃筱鈞 鄧昭敏 張 碩 李明遠(yuǎn)

(湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的數(shù)據(jù)顯示，每年全球約800萬(wàn)人死于癌癥，癌癥已成為世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)每年新發(fā)腫瘤病例約為312萬(wàn)例，其中50歲以上人群惡性腫瘤發(fā)病率占全部發(fā)病的80%以上，80歲達(dá)到高峰，居民因癌癥死亡率是13%〔1〕。腫瘤嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量，威脅著老年人的健康。傳統(tǒng)的腫瘤治療面臨著特異性不高、靶向性不強(qiáng)、難以對(duì)實(shí)體腫瘤的乏氧區(qū)發(fā)揮作用等方面的挑戰(zhàn)，迫切需要新療法。1813年，Vautier觀察到腫瘤患者感染氣性壞疽后，患者體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)減緩甚至消退，這一現(xiàn)象引起了人們對(duì)細(xì)菌抗腫瘤的關(guān)注。Coley等〔2〕做出了積極的探索，卡介苗(BCG)已成功用于臨床治療淺表性膀胱癌。隨著對(duì)厭氧菌的腫瘤特異性靶向定植認(rèn)識(shí)的深入和生物技術(shù)的發(fā)展，利用厭氧菌治療腫瘤顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

1 厭氧菌抗腫瘤的基礎(chǔ)

腫瘤組織內(nèi)部特殊病理生理特點(diǎn)和厭氧菌自身的生物學(xué)特性是厭氧菌抗腫瘤應(yīng)用研究的基礎(chǔ)：①腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)快，而瘤內(nèi)血管形態(tài)不規(guī)則、分支紊亂，實(shí)體腫瘤內(nèi)部形成乏氧微環(huán)境，有利于厭氧菌靶向定植于腫瘤組織；②腫瘤組織代謝旺盛，產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物，可供厭氧菌利用，厭氧菌在瘤內(nèi)比正常組織具備更強(qiáng)的增殖能力，更易在腫瘤內(nèi)富集；③腫瘤內(nèi)異常血管化和腫瘤組織間隙的高壓使瘤內(nèi)免疫細(xì)胞、抗體、補(bǔ)體等數(shù)量減少且功能受到抑制，厭氧菌在瘤內(nèi)較難被免疫系統(tǒng)識(shí)別、清除；④某些厭氧菌為益生菌或無(wú)致病性，致病性厭氧菌所致的繼發(fā)性感染可通過(guò)抗生素得到較好控制；⑤厭氧菌基因容量較大，可進(jìn)行基因修飾，具備穩(wěn)定表達(dá)外源基因的能力，是良好的基因載體；⑥厭氧菌的安全性較高，便于保存，無(wú)潛在的長(zhǎng)期副作用。

2 厭氧菌在腫瘤治療中的研究

過(guò)去十多年，梭狀芽孢桿菌屬、沙門(mén)菌屬、雙歧桿菌屬作為基因載體和靶向抗腫瘤研究最多〔3〕。厭氧菌在治療肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、膀胱癌等方面顯示出較好的效果。Dang等〔4〕從26株細(xì)菌中篩選出具有高度腫瘤靶向定植能力的野生型諾氏梭菌(Clostridium.novyi,C.novyi)，采用熱休克法去除其毒性基因，得到無(wú)毒諾氏梭菌(C.novyi-NT)，聯(lián)合Dolastatin-10、絲裂霉素、環(huán)磷酰胺、長(zhǎng)春新堿等常規(guī)化療藥物治療小鼠皮下移植瘤HCT116、結(jié)腸癌和B16黑色素瘤，用藥24 h后腫瘤內(nèi)出現(xiàn)出血性壞死，顯著延長(zhǎng)了藥物的治療時(shí)間和實(shí)驗(yàn)鼠的生存周期，87.5%的腫瘤消退，連續(xù)觀察3個(gè)月，80%的實(shí)驗(yàn)鼠達(dá)到病理學(xué)意義上的治愈。Fox等〔5〕將大腸桿菌胞嘧啶脫氨基酶(CD)的基因克隆到拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)表達(dá)載體后聯(lián)合治療EMT6荷瘤小鼠，癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶(5-FU)的敏感性提高500倍。Li等〔6〕用青春雙歧桿菌(B.adolescentis)攜帶編碼內(nèi)皮抑素基因的質(zhì)粒作用于肝癌小鼠模型，腫瘤生長(zhǎng)抑制率達(dá)69.9%。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門(mén)菌(Salmonellatyphimurium)VNP20009株可以抑制多種鼠源及人源移植瘤(包括轉(zhuǎn)移灶)的生長(zhǎng)，包括鼠、人黑色素瘤，人結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等，VNP20009聚集在腫瘤部位的量是正常組織的1 000倍，動(dòng)物的生存時(shí)間延長(zhǎng)〔7〕。減毒沙門(mén)菌VNP20009Ⅰ期臨床試驗(yàn)表現(xiàn)出較好的安全性；單獨(dú)使用C.novyi-NT芽孢或聯(lián)合使用抗微管藥物治療實(shí)體瘤也已經(jīng)進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)〔8〕。

3 厭氧菌抗腫瘤的機(jī)制

厭氧菌在腫瘤治療中的應(yīng)用主要表現(xiàn)為直接溶瘤效應(yīng)、治療基因載體及聯(lián)合溶菌療法等幾個(gè)方面。

3.1直接溶瘤效應(yīng) 某些厭氧菌的菌體成分和代謝產(chǎn)物本身具有細(xì)胞毒性，能直接發(fā)揮溶瘤作用。Baban等〔9〕發(fā)現(xiàn)梭狀芽孢桿菌、沙門(mén)菌能在腫瘤實(shí)體內(nèi)自我增殖，與腫瘤細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)及生長(zhǎng)因子，或其毒性產(chǎn)物破壞腫瘤微環(huán)境，顯示出直接溶瘤效應(yīng)。Mǒse等〔10〕從土壤中分離出無(wú)致病性的酪酸梭狀芽孢桿菌M55，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察到M55靶向定植于腫瘤乏氧區(qū)及較大的壞死區(qū)，表現(xiàn)出溶瘤作用；病理切片顯示，腫瘤中央液化壞死，周邊仍有存活的腫瘤細(xì)胞。Dang等〔4〕使用C.novyi-NT分別治療荷HCT116和B16裸鼠，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制，組織培養(yǎng)和免疫熒光顯微鏡觀察證實(shí)該菌特異性定植于腫瘤組織，且腫瘤壞死區(qū)周?chē)灿屑?xì)菌生長(zhǎng)，蘇木精-伊紅染色見(jiàn)腫瘤中央大量液化壞死，未觀察到裸鼠毒副反應(yīng)表現(xiàn)。S.typhimurium是一種兼性厭氧菌，它在腫瘤壞死區(qū)和活性區(qū)都可以生長(zhǎng)，Zhao等〔11〕將亮氨酸、精氨酸雙向營(yíng)養(yǎng)缺乏型鼠傷寒沙門(mén)菌(S.typhimuriumA1)尾靜脈注射結(jié)腸癌裸鼠模型，觀察到S.typhimuriumA1對(duì)腫瘤的黏附性增強(qiáng)了6倍左右，對(duì)腫瘤組織的侵蝕范圍更廣，表現(xiàn)出強(qiáng)大的溶瘤能力。

3.2治療基因載體 厭氧菌具有安全性高、靶向性強(qiáng)、不易引起正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化、潛在的副作用低、使用方便、易生產(chǎn)和保存等優(yōu)點(diǎn)，使解決腫瘤基因治療缺乏特異性、安全性載體的問(wèn)題有了新的希望。

3.2.1前體藥物轉(zhuǎn)化酶基因載體 細(xì)菌導(dǎo)向的前藥酶療法(BDEPT)是利用厭氧菌將前藥活化酶基因靶向轉(zhuǎn)運(yùn)至腫瘤組織內(nèi)表達(dá)，再全身應(yīng)用無(wú)毒的前藥，使前藥僅能在腫瘤組織內(nèi)被活化成抗腫瘤活性的藥物，從而克服直接應(yīng)用化療藥物無(wú)選擇性、瘤內(nèi)濃度低、易引起毒副作用及耐藥性的不足〔12〕。胞嘧啶脫氨酶(CDase)是前體藥5-氟胞嘧啶(5-FC)的活化酶，能將5-FC活化成放射敏感性的毒性5-FU。Matsumura等〔13〕構(gòu)建了攜帶質(zhì)粒pBLES100-S-eCD的長(zhǎng)雙歧桿菌105-A，利用其表達(dá)的CDase基因?qū)?-FC轉(zhuǎn)換成抑制腫瘤生長(zhǎng)的5-FU來(lái)治療腫瘤，降低了傳統(tǒng)化療藥物的不良反應(yīng)。Mei等〔14〕將CDase導(dǎo)入減毒沙門(mén)菌VNP20009內(nèi)，聯(lián)合5-FC靜脈注射荷瘤鼠，在腫瘤組織內(nèi)檢測(cè)到活化的5-FU，而其他正常組織未發(fā)生轉(zhuǎn)化。Mionton等〔15〕構(gòu)建了C.beijerinckiiNCIMB8052重組體，表達(dá)來(lái)源于大腸桿菌的CDase或硝基還原酶(NTR)。Theys等〔16〕將NTR 轉(zhuǎn)入?yún)捬跹挎咚缶o脈注射重組菌芽孢，抑制腫瘤生長(zhǎng)的能力顯著增強(qiáng)。Liu等〔17〕應(yīng)用梭狀芽孢桿菌兩個(gè)內(nèi)源性強(qiáng)啟動(dòng)子(thlP和abrBP)代替原始啟動(dòng)子fdP，構(gòu)建出新的NTR表達(dá)載體，其表達(dá)能力提高了近20倍。體內(nèi)試驗(yàn)表明，梭狀芽孢桿菌能有效地將前體藥CB1954轉(zhuǎn)化為腫瘤毒性藥物，表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效應(yīng)。

3.2.2細(xì)胞因子基因載體 厭氧菌也常用作細(xì)胞因子的表達(dá)載體，通過(guò)促發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路，引起腫瘤細(xì)胞凋亡，或誘導(dǎo)免疫反應(yīng)間接清除腫瘤細(xì)胞。Hu等〔18〕將攜帶腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體質(zhì)粒的長(zhǎng)雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum,B.longum)注射荷瘤小鼠，小鼠骨肉瘤縮小。Yi等〔19〕利用嬰兒雙歧桿菌攜帶pGEX-1λT質(zhì)粒注射小鼠，小鼠惡性黑色素瘤的生長(zhǎng)受到抑制。Tang等〔20〕用嬰兒雙歧桿菌攜帶胸腺嘧啶激酶自殺基因質(zhì)粒靜脈注射荷膀胱癌小鼠，腫瘤的體積明顯減小。還有研究人員利用B.adolescentis和B.longum攜帶抗血管生成因子，將其注射入荷瘤小鼠體內(nèi)，腫瘤血管生成受到抑制，腫瘤的體積亦明顯減小。Lee等〔21〕用攜帶有內(nèi)皮他丁表達(dá)載體的減毒豬霍亂沙門(mén)菌(S.choleraesuis)靜脈注射荷MTB-2腫瘤小鼠，腫瘤生長(zhǎng)被抑制，小鼠存活時(shí)間延長(zhǎng)，免疫組化分析顯示腫瘤內(nèi)微血管密度減小，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)減少、細(xì)胞滲透增加。Loeffler等〔22〕用轉(zhuǎn)有LIGHT細(xì)胞因子的減毒鼠傷寒沙門(mén)菌治療荷D2F2乳腺癌小鼠，流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中B細(xì)胞和CD4+T 、CD8+T細(xì)胞大量增加。Agorio等〔23〕將攜帶鼠白介素(IL)-4或IL-18基因的減毒傷寒沙門(mén)菌，口飼荷黑色素瘤小鼠，2 d后發(fā)現(xiàn)重組菌在瘤內(nèi)聚集，無(wú)論重組菌攜帶IL-4 還是IL-18基因，均能抑制腫瘤生長(zhǎng)，顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存時(shí)間，小鼠血清中干擾素(IFN)-γ含量增加。Bermúdez-Hmarán等〔24〕將表達(dá)HPV16 E7抗原和IL-12的乳酸桿菌制成疫苗，接種小鼠后能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，當(dāng)以致死量攻擊表達(dá)E7抗原的TC-1腫瘤細(xì)胞時(shí)，小鼠獲得保護(hù)。對(duì)載體菌特性的分析表明，乳酸桿菌固有的免疫調(diào)節(jié)功能在表達(dá)抗原免疫原性時(shí)起重要作用〔25〕。使用活菌提高機(jī)體的免疫功能也是治療腫瘤的策略之一〔26〕。

3.3聯(lián)合溶菌療法 腫瘤乏氧區(qū)血供較差，化療藥物難以到達(dá)。放療殺死細(xì)胞離不開(kāi)氧，因此放療一般只能殺死腫瘤邊緣有氧區(qū)的細(xì)胞，而乏氧區(qū)成為死角，造成腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，厭氧菌聯(lián)合放療或(和)化療、射頻消融治療能增強(qiáng)抗腫瘤效果，統(tǒng)稱聯(lián)合溶菌療法(COBALT)。

3.3.1厭氧菌聯(lián)合化療 厭氧菌聯(lián)合化療藥物治療腫瘤可以起到相互協(xié)同作用。阿霉素的脂質(zhì)體Doxil能穿透腫瘤血管內(nèi)皮在瘤內(nèi)聚集，并在循環(huán)系統(tǒng)長(zhǎng)期存留。Cheong等〔27〕聯(lián)合使用C.novyi-NT和Doxil靜脈注射荷瘤小鼠，腫瘤消退更明顯，動(dòng)物存活時(shí)間延長(zhǎng)。體內(nèi)藥物分布分析顯示，聯(lián)合治療方案中阿霉素在腫瘤內(nèi)濃度更高。Lee等〔28〕用減毒豬霍亂沙門(mén)菌聯(lián)合順鉑治療荷肝腫瘤或肺腫瘤小鼠，腫瘤生長(zhǎng)顯著抑制，小鼠生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，腫瘤內(nèi)中性粒細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增加，凋亡細(xì)胞也增加。

3.3.2厭氧菌聯(lián)合放療 乏氧增加了腫瘤對(duì)放射治療的抗性。由于缺氧，這些區(qū)域無(wú)法產(chǎn)生足夠的用來(lái)破壞增殖細(xì)胞DNA的氧自由基。利用厭氧菌對(duì)乏氧區(qū)的破壞作用可增強(qiáng)放療的效應(yīng)。Bettegowda等〔29〕用C.novyi-NT分別聯(lián)合遠(yuǎn)距放療、近距放療、放射免疫三種放療方法進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示C.novyi-NT能顯著提高放療效果，減少放療劑量，其中與近距放療聯(lián)合方案治愈率達(dá)到100%。破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞可能是放療發(fā)揮作用的重要機(jī)制，因此與抗血管藥物類(lèi)似，放療還起到了協(xié)同C.novyi-NT的作用。Bettegowda等〔29〕利用C.novyi-NT破壞腫瘤乏氧區(qū)，聯(lián)合放療或131I -單克隆抗體放射免疫療法可減緩小鼠移植瘤的生長(zhǎng)。Platt等〔30〕聯(lián)合VNP20009與X線治療腫瘤，結(jié)果顯示出超疊加作用，放療同時(shí)增強(qiáng)了VNP20009抗腫瘤效應(yīng)。

3.3.3厭氧菌聯(lián)合射頻消融治療 射頻消融(RF)能擴(kuò)大腫瘤壞死區(qū)，為厭氧菌提供理想的增殖微環(huán)境。Wei等〔31〕利用C.oncolyticumM55芽胞治療861只小鼠頸部誘發(fā)腫瘤，試驗(yàn)結(jié)果均顯示RF顯著增強(qiáng)了C.oncolyticumM55的溶瘤效果；對(duì)快速生長(zhǎng)的Ehrlich腺癌，RF治療12 h后全身應(yīng)用細(xì)菌芽孢效果最佳；對(duì)慢速增長(zhǎng)的Ehrlich腺癌，RF+C.oncolyticumM55芽孢靜脈注射+放療三種方法聯(lián)合治療，治愈率為20%，生存時(shí)間延長(zhǎng)，但原位復(fù)發(fā)仍使余下小鼠最終死亡。

4 展望

厭氧菌在腫瘤生物治療的應(yīng)用中顯示出其優(yōu)越性，但其確切的機(jī)制還待深入研究。借助基因工程及宏基因組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步改造厭氧菌，使其更安全，成為更多治療藥物的載體，同時(shí)解決厭氧菌抗腫瘤窗口期的選擇、腫瘤大小的選擇、厭氧菌與腫瘤的量效關(guān)系、腫瘤非低氧區(qū)和小轉(zhuǎn)移灶的治療、減毒株毒力回復(fù)、溶瘤綜合征及厭氧菌單用或聯(lián)合放、化療及RF治療腫瘤的類(lèi)型、給藥方法等問(wèn)題之后，厭氧菌在腫瘤治療中的應(yīng)用將會(huì)有更大突破。

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