肝母細(xì)胞瘤中的干細(xì)胞表面標(biāo)記物的初步識(shí)別＊

張守華，肖菊花，鄧慶強(qiáng)，徐紅艷，羅 鳴，諶衛(wèi)龍，雷 俊，陶 強(qiáng)△

（1.江西省兒童醫(yī)院普外科，南昌 330006；2.江西省婦幼保健院超聲診斷科，江西南昌 330006）

肝母細(xì)胞瘤中的干細(xì)胞表面標(biāo)記物的初步識(shí)別＊

張守華1，肖菊花2，鄧慶強(qiáng)1，徐紅艷1，羅 鳴1，諶衛(wèi)龍1，雷 俊1，陶 強(qiáng)1△

（1.江西省兒童醫(yī)院普外科，南昌 330006；2.江西省婦幼保健院超聲診斷科，江西南昌 330006）

目的初步篩選出肝母細(xì)胞瘤（HB）中的腫瘤干細(xì)胞（NSC）相關(guān)表面標(biāo)記組合，并了解NSC的分布。方法選擇入住江西省兒童醫(yī)院并接受手術(shù)的HB患兒，采用免疫組織化學(xué)染色的方法，觀察干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物CD34、Thy-1、c-kit、CD56和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF），在HB組織及距腫瘤組織邊緣3cm以外的正常肝臟組織的表達(dá)和分布。結(jié)果Thy-1、c-kit散在分布于HB組織中，主要集中在匯管區(qū)，而正常肝臟組織中不表達(dá)；CD34及SCF在HB中的表達(dá)明顯高于正常肝臟組織（P＜0.05），其中CD34主要在血管內(nèi)皮系統(tǒng)中分布，SCF主要表達(dá)在匯管區(qū)；CD56表達(dá)于成簇的神經(jīng)纖維組織中，在HB及正常肝臟組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論不同干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志物分布于HB組織中，并且集中表達(dá)在特定區(qū)域。表達(dá)Thy-1／c-kit陽性細(xì)胞可能對(duì)HB的發(fā)生起一定作用。

腫瘤干細(xì)胞；肝母細(xì)胞瘤；抗原，CD34；抗原，Thy-1；原癌基因蛋白質(zhì)c-kit

腫瘤干細(xì)胞（neoplastic stem cells，NSC）的存在已在許多腫瘤細(xì)胞株及原發(fā)性腫瘤中得到了證實(shí)。NSC學(xué)說認(rèn)為，腫瘤組織由異質(zhì)性的細(xì)胞組成，其中有極少部分細(xì)胞亞群具有起始腫瘤的能力，它們雖然數(shù)量極少，卻在腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起重要作用。目前如白血病、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等中均證實(shí)了NSC的存在［1］，可是肝母細(xì)胞瘤（hepatocastoma，HB）的NSC卻一直未能確定，而篩選出合適的表面標(biāo)記組合是有效分離和鑒定NSC的前提。本文旨在初步探討HB的NSC相關(guān)表面標(biāo)記物存在的合理性，為后續(xù)的NSC標(biāo)記物分離和確定提供依據(jù)和參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2002～2012年江西省兒童醫(yī)院普外科收治的HB患兒8例（腫瘤組），其中男5例，女3例，年齡15d～10歲，平均發(fā)病年齡為19.8個(gè)月，術(shù)前未經(jīng)放療、化療，8例患兒均手術(shù)完整切除并經(jīng)病理檢查診斷為HB，根據(jù)病理分型，其中上皮型4例，混合型4例。取距腫瘤組織邊緣3cm以外的正常肝臟組織作為對(duì)照組。

1.2 方法 標(biāo)本組織離體后立即取材，并以4% 多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片。石蠟包埋組織切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，抗原修復(fù)，然后采用常規(guī)SP免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CD34、Thy1、c-kit以及干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF）和CD56的蛋白表達(dá)情況。由兩位病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片，在光學(xué)顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞的分布特征。以出現(xiàn)棕黃色、高出背景色者為陽性細(xì)胞。選取具有代表性的腫瘤區(qū)域，在高倍鏡下（×400）隨機(jī)選取10個(gè)視野，記錄陽性細(xì)胞占組織細(xì)胞的百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

本文8例患兒 HB組織中均可見到表達(dá)CD34、Thy-1、ckit、SCF和CD56陽性細(xì)胞，其中Thy1、c-kit散在分布于腫瘤組織，主要集中在匯管區(qū)（圖1A、B），而在正常肝臟組織中不表達(dá)（圖1C）；CD34主要表達(dá)于血管內(nèi)皮系統(tǒng)，HB組織中的表達(dá)明顯高于正常肝臟組織（圖1D、E，P＜0.05）；SCF陽性細(xì)胞主要分布于匯管區(qū)，HB中的表達(dá)明顯高于正常肝臟組織（圖1F、G，P＜0.05）；CD56表達(dá)于成簇的神經(jīng)纖維組織中，二者表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1H，P＞0.05）。兩組CD34、SCF和CD56的表達(dá)比較，見表1。

圖1 HB及正常肝臟組織中相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)（×400）

表1 兩組CD34、SCF等表達(dá)比較（±s，n＝8）

表1 兩組CD34、SCF等表達(dá)比較（±s，n＝8）

組別0.32±0.09 0.43±0.09 0.11±0.04對(duì)照組 0.17±0.07 0.11±0.04 0.09±0.09 P＜0.01 ＜0.01 ＞0.05 CD34 SCF CD56腫瘤組

3 討 論

HB是小兒最常見的肝臟原發(fā)性惡性腫瘤，在小兒惡性實(shí)體性腫瘤中，HB發(fā)病率僅次于腎母細(xì)胞瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤，位于第3位［2］。兒童HB是一種胚胎性腫瘤，其有未成熟的胚胎性組織，這些組織持續(xù)增生，形成發(fā)育幼稚的組織塊而可能轉(zhuǎn)化成惡性的母細(xì)胞瘤。HB病理組織學(xué)上可分為上皮型及混合型［3］。上皮型又分為4個(gè)亞型：胎兒性、胚胎型、巨梁型、小細(xì)胞未分化型。HB明確的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，有學(xué)者認(rèn)為可能與染色體異常、低出生體質(zhì)量、母體妊娠期不良外界因素等有關(guān)。HB的預(yù)后不容樂觀，特別是在中國，由于患兒就診較晚，手術(shù)完整切除率低，治療不規(guī)范，3年生存率小于50%［4］。但近年NSC理論的出現(xiàn)在一定程度上為HB的發(fā)病機(jī)制、治療和預(yù)后提供了新的視角。該理論認(rèn)為，NSC是存在于腫瘤細(xì)胞中的一個(gè)亞群，具有高度自我更新及無限增殖能力，呈不對(duì)稱分裂，大量事實(shí)證實(shí)其與腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及耐藥密切相關(guān)。許多腫瘤如乳腺癌、前列腺癌等，均分離出了NSC，但HB的NSC表面標(biāo)記物一直未能確定。

卵圓細(xì)胞是人們目前公認(rèn)的肝組織中的肝源性肝干細(xì)胞，是肝內(nèi)膽管系統(tǒng)源性的多潛能分化細(xì)胞群，可以分化為膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞［5］。OV6、SCF、c-kit、CK-8、CD34、CD49、Thy－1、AFP等被認(rèn)為是卵圓細(xì)胞表達(dá)相對(duì)較高的標(biāo)志物，其某些標(biāo)志物可以作為今后肝NSC篩選的參考標(biāo)志物。本研究基于此前對(duì)肝臟干細(xì)胞的研究，結(jié)合文獻(xiàn)［6-7］報(bào)道，初步設(shè)想HB的NSC相關(guān)幾個(gè)表面標(biāo)記物并驗(yàn)證其合理性。本研究采用免疫組織化學(xué)染色的方法，觀察表達(dá)CD34、Thy1、c-kit、SCF和CD56的陽性細(xì)胞在HB組織及正常肝臟組織的表達(dá)情況和分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Thy-1、c-kit散在分布于 HB組織，主要集中在匯管區(qū)，而正常肝臟組織中表達(dá)為陰性。Thy-1是相對(duì)分子質(zhì)量為25～37×103的細(xì)胞表面糖蛋白，通過二酰甘油（DAG）錨定于糖基磷脂酰肌醇（GPI）的C末端而附著在細(xì)胞膜的胞漿面，參與細(xì)胞的分化、識(shí)別、遷徙等功能。人類許多實(shí)體瘤細(xì)胞（包括腦瘤、皮膚癌）中都有Thy-1的表達(dá)，廣泛分布于許多惡性腫瘤中。有研究表明在某些腫瘤如肝癌、肺癌等組織中，其表達(dá)情況與病理類型、腫瘤轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)。Yang等［8］從肝癌細(xì)胞株和肝癌組織中篩選出Thy-1陽性細(xì)胞，異種移植入重癥復(fù)合型免疫缺陷病小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其有致瘤性，病理提示符合肝細(xì)胞肝癌的診斷，進(jìn)一步指出Thy-1陽性肝癌細(xì)胞具有自我更新、多向分化和高致瘤性等生物學(xué)特性，是肝癌干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。c-kit基因位于人染色體4q12-13，屬于原癌基因，其產(chǎn)物是Ⅲ型酪氨酸激酶，編碼145×103的跨膜糖蛋白，c-kit受體分布于細(xì)胞表面，結(jié)構(gòu)類似于粒－巨核細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和血小板源生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）［9］。c-kit與其配體結(jié)合后，誘導(dǎo)其胞外區(qū)的構(gòu)象發(fā)生變化，使受體在細(xì)胞膜上遷移、聚集，形成二聚體，使得酪氨酸激酶磷酸化，繼而激活酪氨酸激酶功能區(qū)，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)多個(gè)蛋白質(zhì)持續(xù)磷酸化，這些效應(yīng)分子的磷酸化促發(fā)細(xì)胞間信號(hào)的瀑布級(jí)鏈反應(yīng)，調(diào)控c-kit的下游底物，包括 MAPK、Ras-Raf-MAP、JAK／STAT等多條信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終活化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)，控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化［10］。諸如急性髓細(xì)胞白血病、肺癌、肝癌等惡性腫瘤均有c-kit的表達(dá)，有些腫瘤如胃腸道間質(zhì)瘤，甚至認(rèn)為c-kit是其特征性標(biāo)記物［11］。c-kit基因誘導(dǎo)腫瘤有兩種方式，（1）c-kit基因的過表達(dá)，激活下游信號(hào)通路，引起腫瘤的過度增殖所導(dǎo)致；（2）c-kit基因發(fā)生突變，導(dǎo)致非配體依賴性的受體二聚體形成，從而激活c-kit的酪氨酸激酶活性，并持續(xù)刺激下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起細(xì)胞不斷的生長(zhǎng)、增殖，最終成為腫瘤細(xì)胞［12］。結(jié)合Thy-1和ckit的特性本研究發(fā)現(xiàn)，其主要在HB組織的匯管區(qū)表達(dá)，而在正常肝組織中不表達(dá)或表達(dá)極少。由此，本研究推測(cè)Thy-1／ckit陽性細(xì)胞可能在HB的發(fā)生起一定作用。

SCF又稱肥大細(xì)胞生長(zhǎng)因子，SCF可以促使處于G0期的干細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂周期，以此促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和分化。另外，SCF還可抑制細(xì)胞凋亡過程，從而提高細(xì)胞的存活力［13－14］。SCF在人體肝臟、骨髓、胎盤、睪丸和腎臟等多種組織和細(xì)胞中都有表達(dá)，特別是干細(xì)胞群體更是高表達(dá)。有研究表明，在肺癌、神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、前列腺癌等均有c-kit和SCF共表達(dá)現(xiàn)象。CD34在血管內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)，在腫瘤組織中是判斷新生血管、侵襲性、惡性程度的重要指標(biāo)［15］。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CD34及SCF在HB組織中的表達(dá)明顯高于正常肝組織，這可能與腫瘤新生血管、惡性程度有關(guān)，與NSC的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。CD56是神經(jīng)細(xì)胞黏附分子的一種糖蛋白，位于中樞和外周神經(jīng)細(xì)胞及纖維膜表面，在神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CD56均表達(dá)于HB以及正常肝臟組織中成簇的神經(jīng)纖維組織，二者在數(shù)量、分布未見明顯差異。

HB是兒童最常見的肝臟原發(fā)惡性腫瘤，其最基本的治療方法是手術(shù)切除或通過化療增加可切除的HB病例數(shù)［16］。但部分病例因原發(fā)性、繼發(fā)性或多藥耐藥性而對(duì)化療不敏感，預(yù)后極差。NSC理論在一定程度上為治療提供了新的視角，鑒定和篩選HB中NSC并了解表面標(biāo)記組合的相關(guān)調(diào)控機(jī)制和信號(hào)通路，對(duì)發(fā)現(xiàn)潛在的藥物靶點(diǎn)，進(jìn)而為臨床治療、提高治愈率和長(zhǎng)期存活率都具有重要意義。

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Preliminary recognition of stem cells surface markers in hepatoblastoma＊

ZhangShouhua1，XiaoJuhua2，DengQingqiang1，XuHongyan1，LuoMing1，ChenWeilong1，LeiJun1，TaoQiang1△
（1.DepartmentofGeneralSurgery，JiangxiProvincialChildren′sHospital，Nanchang，Jiangxi330006，China；
2.DepartmentofUltrasoundDiagnosis，JiangxiProvincialMaternalandChildHealthCareHospital，Nanchang，Jiangxi330006，China）

ObjectiveTo preliminarily screen the neoplastic stem cell（NSC）related surface markers combination and to understand the NSC distribution in hepatoblastoma（HB）.MethodsThe children cases of HB undergone the surgical therapy in the Jiangxi Provincial Children′s Hospital were selected.The immunohistochemical method was adopted for observing the expression and distribution of NSC-related markers CD34，Thy-1，c-kit，CD56and stem cell factor（SCF）in the HB tissue and the normal hepatic tissue away from the edge of tumor tissue 3cm outside.ResultsThy-1and c-kit were sporadically distributed in the HB tissue and mainly focued on the portal area，but did not exressed in the normal liver tissue；the expression of CD34and SCF in HB was significantly higher than that in the normal liver tissue（P＜0.05），in which CD34was mainly distributed in the endothelial system and SCF was mainly expressed in the portal area；CD56was expressed in the tissue of the clustered nerve fibers，the expression difference between them had no statistical significance（P＞0.05）.ConclusionThe different NSC related surface markers are distributed in the HB tissue and focus on the specific areas.The positive cells of Thy-1／c-kit expression may play a role in the HB occurrence.

neoplastic stem cells；hepatoblastoma；antigens，CD34；antigens，Thy-1；proto-oncogene proteins c-kit

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.10.020

A

1671-8348（2014）10-1208-03

江西省衛(wèi)生廳課題資助項(xiàng)目（20131137）。

張守華（1982－），主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事兒童腫瘤以及干細(xì)胞研究?！?/p>

，Tel：13979170606；E-mail：taoqiang＿2008＠126.com。

2013-09-18

2013-11-25）

·論 著·