MicroRNAs在支氣管哮喘中的研究進(jìn)展①

卞勇華 崔玉寶(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，鹽城 224005)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的，以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性(Airway hyper responsiveness，AHR)、可逆性氣道阻塞為特征的氣道慢性炎癥性疾病。據(jù)估計(jì)全球約有3億哮喘患者，每年有25萬人死于哮喘?。?］。氣道炎癥是哮喘最主要的病理變化，以肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、Th2細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤為主要特征，并決定氣道阻塞和AHR的程度。Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-9、IL-13)與氣道炎癥密切相關(guān)，并可以促進(jìn)IgE的產(chǎn)生、嗜酸性粒細(xì)胞的增殖和分化、黏液的分泌，誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)性和氣道重塑［2，3］。氣道重塑被認(rèn)為是哮喘難治的根本原因，近年來受到了研究者的高度重視，但是目前尚缺乏有效的防治措施。

目前對于哮喘主要是應(yīng)用糖皮質(zhì)激素(如地塞米松)和β-2受體激動(dòng)劑(如沙丁胺醇、沙美特羅等)進(jìn)行治療。雖然這些藥物通過控制氣道炎癥和舒張氣道平滑肌(Airway smooth muscle，ASM)極大改善了哮喘患者的癥狀，但是副作用明顯，如發(fā)音困難、鵝口瘡和心律失常等［4］。此外，還有相當(dāng)一部分哮喘患者對糖皮質(zhì)激素并不敏感。因此，急需尋找一種新的、有效的、副作用少的方法來治療哮喘。

MicroRNAs(miRNAs)是一種長度約為22個(gè)核苷酸(nucleotide，nt)的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通過對靶基因mRNA的降解或者抑制其翻譯，負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNAs在癌癥、病毒感染、肺部炎癥性疾病均發(fā)揮了重要的功能［6-8］。本文就近年來miRNAs在哮喘發(fā)病中的作用及潛在的應(yīng)用前景作一綜述。

1miRNAs概述

隨著1993年第一個(gè)miRNA(lin-4)在線蟲中被發(fā)現(xiàn)，越來越多的miRNAs在不同物種被發(fā)現(xiàn)，截止到2013年6月miRBase 20(www.mirbase.org)顯示:已注冊miRNAs含有發(fā)夾結(jié)構(gòu) miRNAs前體序列24 521個(gè)，成熟miRNAs序列30 424個(gè)。大量研究表明，miRNAs廣泛參與細(xì)胞增殖、分化及凋亡、應(yīng)激反應(yīng)、免疫反應(yīng)等多種生物活動(dòng)過程［9，11］。miRNAs由大小為60～75個(gè) nt具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miRNAs前體(pre-miRNAs)剪切生成，成熟的miRNAs在細(xì)胞質(zhì)中與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)結(jié)合，形成miRNAs沉默復(fù)合體。miRNAs沉默復(fù)合體通過miRNAs 5'端6～8個(gè) nt的種子序列互補(bǔ)結(jié)合靶mRNA的3'端的非翻譯區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)阻斷核糖體讀取mRNA或者直接降解mRNA，調(diào)控靶 mRNA 的表達(dá)［5］。

miRNAs代表一類新的藥物靶標(biāo)，可以通過反義抑制或過表達(dá)miRNAs治療相應(yīng)疾?。?2］。反義抑制miRNAs方法包括使用2'-OMe或鎖核苷酸(Locked nucleic acid，LNA)修飾的反義寡聚核苷酸(Anti-miRs)和膽固醇分子偶聯(lián)的寡聚核苷酸(Antago-miRs) 結(jié)合miRNAs使其失活［13，14］。miRNAs表達(dá)下調(diào)所引起的疾病可以使用miRNA類似物或成熟的miRNAs進(jìn)行替代治療。表達(dá)短發(fā)夾RNAs的質(zhì)粒或病毒載體可用于miRNAs的過表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)，因?yàn)檫@種方法可以方便地通過一個(gè)轉(zhuǎn)錄物表達(dá)多個(gè) miRNAs［15］。通過這些方法調(diào)節(jié)miRNAs功能為哮喘的治療提供一種新的思路。

2miRNAs與哮喘

雖然目前對于miRNAs與哮喘關(guān)系的研究相對較少，但現(xiàn)有研究表明miRNAs與哮喘的疾病進(jìn)程密切相關(guān)。例如，Garbacki等［16］對急性、亞急性和慢性小鼠哮喘模型的肺組織miRNAs表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)8個(gè)可能與哮喘相關(guān)的候選miRNAs。Tsitsiou等［17］對哮喘患者miRNAs表達(dá)譜分析證實(shí)，重度哮喘患者 CD8+和CD4+T細(xì)胞中miR-28-5p和 miR-146a/b表達(dá)選擇性下調(diào)與mRNA表達(dá)的廣泛變化相關(guān)。

2.1 miRNAs與細(xì)胞因子及炎癥

2.1.1 miR-126 通過對小鼠哮喘模型的研究，Mattes等［18］報(bào)道塵螨(House dust mite，HDM)誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘模型氣道中miR-126的表達(dá)顯著上調(diào)，而通過antago-miR-126抑制其表達(dá)可緩解哮喘特征性反應(yīng)如氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性、Th2型細(xì)胞因子(如IL-5和 IL-13)分泌、氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和黏液分泌。miR-126的表達(dá)上調(diào)依賴于TLR4/MyD88信號(hào)通路，因?yàn)镠DM誘導(dǎo)的Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)或髓樣分化因子88(Myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88)缺陷小鼠均未出現(xiàn)miR-126的表達(dá)上調(diào)，并且AHR降低和氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤減少。然而，Collison等［19］發(fā)現(xiàn)在卵白蛋白(Ovalbumin ，OVA)誘導(dǎo)的小鼠慢性哮喘模型中miR-126在誘導(dǎo)的最初2周表達(dá)上調(diào)，6周后下降至基線水平附近。通過antago-miR-126抑制miR-126的表達(dá)，只能減少小鼠慢性哮喘模型氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，而對氣道慢性炎癥和氣道重塑不產(chǎn)生影響，提示可能有多種miRNAs參與了哮喘發(fā)生的調(diào)控。

2.1.2 Let-7 Let-7家族是miRNAs中研究最為深入的家族之一，其家族成員在不同的物種高度保守。人類let-7家族有11個(gè)成員(let-7a-g、let-7i-k、mir-202)，其中 let-7j和 let-7k 在小鼠是不表達(dá)的［20］。IL-13與哮喘的發(fā)病密切相關(guān)，可引起氣道反應(yīng)性增高、嗜酸粒細(xì)胞浸潤和黏液分泌增多［21］。Polikepahad等［22］通過熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)IL-13是let-7a的直接作用靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)反義抑制let-7a可提高小鼠CD4+T細(xì)胞中IL-13 mRNA的表達(dá)水平，推測let-7a可能是哮喘的抗炎因子。然而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，抑制OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中l(wèi)et-7a-d表達(dá)可減少哮喘小鼠支氣管肺泡灌洗液(Broncho alveolar lavage fluid，BALF)中炎癥細(xì)胞浸潤，降低Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)表達(dá)水平，提示let-7在哮喘發(fā)生過程中具有促炎作用［22］。但是，Kumar等［23］研究結(jié)果卻與此相反，他們的研究證實(shí)let-7哮喘發(fā)生過程中具有抗炎作用，可直接抑制IL-13的表達(dá)，并且在OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型肺組織中l(wèi)et-7家族成員(let-7a-d、let-7f-g、let-7i)表達(dá)下調(diào)。鼻腔給予let-7類似物，可以緩解OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型氣道炎癥、降低AHR、減少氣道黏液分泌和纖維化。因此，Let-7在哮喘發(fā)生過程中的功能還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

2.1.3 miR-21 Lu等［24］第一次證實(shí) miR-21在哮喘發(fā)生過程中具有重要功能，在OVA、煙曲霉菌、IL-13轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中均觀察到miR-21表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-21通過調(diào)控靶基因 IL-12p35抑制IL-12的表達(dá)。IL-12對維持Th1/Th2平衡起重要作用［25］，IL-12的表達(dá)降低部分解釋了哮喘過高的Th2免疫應(yīng)答。Lu等［26］通過miR-21-/-基因敲除小鼠進(jìn)一步研究 miR-21的功能，發(fā)現(xiàn)OVA誘導(dǎo)的 miR-21-/-基因敲除小鼠哮喘模型肺部嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤較少，BALF中IFNγ和IL-12表達(dá)水平升高，IL-4的表達(dá)水平顯著降低。這些結(jié)果表明miR-21對Th1/Th2的平衡調(diào)節(jié)起重要作用。此外，也有研究報(bào)道m(xù)iR-21可負(fù)反饋調(diào)控程序性細(xì)胞死亡因子4(Programmed cell death 4，PDCD4)的表達(dá)從而發(fā)揮抗炎作用［27］。miR-21的這種雙重作用表明miRNAs調(diào)控的復(fù)雜性，這兩項(xiàng)研究表明miR-21是重要的免疫調(diào)節(jié)分子。

2.1.4 miR-155 miR-155已經(jīng)被證實(shí)在Th1/Th2分化過程中起關(guān)鍵作用。Banerjee等［28］研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-155可促使CD4+T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞，而抑制miR-155的表達(dá)可促使CD4+T細(xì)胞分化為Th2細(xì)胞。Martinez-Nunez等［29］報(bào)道 miR-155可通過調(diào)控IL-13通路影響巨噬細(xì)胞的表型，從而使Th1/Th2平衡向Th1方向偏移。Th1/Th2細(xì)胞之間的比例和功能失衡是哮喘的主要發(fā)病機(jī)制之一，這些研究結(jié)果表明miR-155與哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。Zhang等［30］在哮喘患者外周血CD4+T細(xì)胞中觀察到miR-155的表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)水平與哮喘嚴(yán)重程度相關(guān)，提示miR-155在哮喘發(fā)生過程中具有重要作用。因此，增加miR-155的表達(dá)可能是減緩哮喘發(fā)病和治療的一條新途徑。

2.1.5 miR-145 雖然對哮喘發(fā)生過程中miR-145的作用研究還不充分，但 Collison等［31］發(fā)現(xiàn)其在HDM誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型氣道壁中表達(dá)上調(diào)。Collison等［31］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在第一次HDM誘導(dǎo)前鼻內(nèi)給予anti-miR-145，可明顯減少氣道黏液分泌、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，降低氣道高反應(yīng)性和Th2型細(xì)胞因子(IL-5、IL-13)的表達(dá)水平，與地塞米松的抗炎作用相當(dāng)。而在最后一次HDM誘導(dǎo)前鼻內(nèi)給予anti-miR-145，只能減少氣道黏液分泌和降低氣道高反應(yīng)性，對嗜酸性粒細(xì)胞浸潤不起作用。這些結(jié)果表明miR-145在哮喘發(fā)生過程中具有促炎作用，其具體作用機(jī)制還有待深入研究闡明。

2.1.6 miR-146 miR-146家族包括miR-146a和miR-146b，哮喘患者 miR-146a和 miR-146b表達(dá)水平的改變已經(jīng)被報(bào)道。Tsitsiou等［17］發(fā)現(xiàn)重度哮喘患者體內(nèi) CD4+和 CD8+T細(xì)胞 miR-146a和 miR-146b的表達(dá)下調(diào)。miR-146a的表達(dá)下調(diào)可能與重度哮喘的發(fā)生有關(guān)，因?yàn)橛袌?bào)道證實(shí)在急性和慢性炎癥發(fā)生過程中miR-146a敲除的T細(xì)胞活性增強(qiáng)［32］。但是，也有研究報(bào)道在OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中脾CD4+T細(xì)胞miR-146a和miR-146b的表達(dá)上調(diào)，是哮喘的促炎因子［33］，所以，miR-146a和miR-146b在哮喘發(fā)生過程中的作用還需要進(jìn)一步研究。

2.1.7 miR-106a miR-106a已經(jīng)被證實(shí)可以通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控抑制IL-10的表達(dá)［34］。IL-10是目前已知具有抗炎作用的細(xì)胞因子，研究表明利用攜帶IL-10基因的重組腺病毒治療OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型，可明顯減輕哮喘小鼠的AHR和氣道炎癥［35］。Sharma等［36］報(bào)道在OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型肺部miR-106a的表達(dá)顯著上調(diào)，而IL-10的表達(dá)顯著下調(diào)。利用 anti-miR-106a抑制小鼠哮喘模型肺部miR-106a的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠肺組織中IL-10的表達(dá)增加，AHR和氣道炎癥明顯緩解，Th2免疫應(yīng)答、杯狀細(xì)胞化生以及氣道纖維化明顯減少。作者聲稱，這項(xiàng)工作是第一次在體內(nèi)證明了miRNAs對IL-10表達(dá)的調(diào)控作用，為預(yù)防哮喘發(fā)生提供了一個(gè)新的思路。

2.1.8 miR-221 Mayoral等［37］報(bào)道 miR-221 對活化的肥大細(xì)胞具有特異性作用，可以調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞的脫顆粒、細(xì)胞因子釋放、遷移和黏附。肥大細(xì)胞是參與Ⅰ型超敏反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，提示miR-221可能與Ⅰ型超敏反應(yīng)疾病(如哮喘、過敏性鼻炎)的發(fā)生密切相關(guān)。Liu等［38］發(fā)現(xiàn)miR-221可能在哮喘發(fā)生過程中具有重要的功能，通過miRNAs微陣列分析和定量PCR發(fā)現(xiàn)兒童哮喘患者及OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中miRNA-221和miRNA-485-3p的表達(dá)上調(diào)。Qin等［39］證實(shí)在OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中miR-221表達(dá)上調(diào)，抑制miR-221的表達(dá)可減輕小鼠哮喘模型的氣道炎癥。

2.2 miRNAs與氣道平滑肌

2.2.1 miR-133a與高反應(yīng)性 Chiba等［40］第一次提出miR-133a可能在哮喘中具有重要功能的假說。假說源于miR-133a對心臟肌肉收縮影響的一項(xiàng)研究，推測 miR-133a對于支氣管平滑肌(Bronchial smooth muscle，BSM)可能有類似的作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-133a可負(fù)反饋調(diào)節(jié) ASM細(xì)胞中 RhoA(Ras homolog gene family member A)的表達(dá)，在IL-13刺激人BSM細(xì)胞和OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型中miR-133a表達(dá)下調(diào)，RhoA表達(dá)上調(diào)。RhoA是BSM收縮的一個(gè)關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)BSM的收縮，增強(qiáng) ASM 高反應(yīng)性［41］。Kume 等［42］研究表明RhoA/Rho激酶信號(hào)通路可能是治療哮喘患者氣道高反應(yīng)性的新靶點(diǎn)，通過上調(diào)BSM細(xì)胞中miR-133a的表達(dá)水平抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路可能會(huì)緩解哮喘患者氣道的高反應(yīng)性，當(dāng)然這需要進(jìn)行深入研究。

2.2.2 miR-25與表型改變 雖然平滑肌的高反應(yīng)性是研究熱點(diǎn)，但平滑肌表型的改變也促進(jìn)了平滑肌高反應(yīng)性和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。Kuhn等［43］研究了miRNAs在ASM表型改變中的作用。他們利用IL-1β、TNF-α 和 IFN-γ 混合物模擬炎癥刺激，通過miRNAs微陣列分析和定量PCR發(fā)現(xiàn)在炎癥刺激的ASM細(xì)胞中miR-25表達(dá)顯著下調(diào)。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測靶基因及實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-25可以通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)(RANTES，嗜酸粒細(xì)胞趨化因子等)和調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因及肌球蛋白重鏈等收縮蛋白的表達(dá)，共同影響ASM表型。但是，miR-25是通過對哪些靶基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控來影響ASM表型，還有待進(jìn)一步研究闡明。

2.3 miRNAs與哮喘遺傳因素 HLA-G(Human leukocyte antigen，HLA)是已經(jīng)被證實(shí)的哮喘易感基因［44］，屬于HLAⅠ類基因，其編碼的HLA-G分子主要存在于母胎界面，有助于母胎免疫耐受的產(chǎn)生。Tan等［45］研究發(fā)現(xiàn) HLA-G的單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms，SNPs)與哮喘易感性相關(guān)，并且可以影響miRNAs對HLA-G的調(diào)控。HLA-G SNP位點(diǎn)(+3142C/G)位于miR-152家族(miR-148a、miR-148b、miR-152)與 HLA-G 結(jié)合的靶點(diǎn)。HLA-G+3142G/G基因型與miR-152家族的結(jié)合較+3142C/C基因型結(jié)合穩(wěn)定，提示SNP位點(diǎn)(+3142C/G)有可能是通過干擾miR-152家族與HLA-G的結(jié)合，從而影響miR-152家族對HLA-G的調(diào)控。Nicodemus-Johnson等［46］研究發(fā)現(xiàn)母親是否患有哮喘將影響哮喘患者miR-148b和可溶性HLAG分子(sHLA-G)的表達(dá)。母親患有哮喘的患者氣道上皮細(xì)胞中miR-148b的表達(dá)顯著下調(diào)，BALF中sHLA-G分子濃度與SNP位點(diǎn)(+3142C/G)基因型密切相關(guān)。這提示miR-152家族對HLA-G的調(diào)控不僅與哮喘患者的HLA-G基因型有關(guān)，而且還與其母親是否患有哮喘相關(guān)。

Su 等［47］進(jìn)行了pre-miRNAs的SNPs研究，在其前期工作基礎(chǔ)上選擇了4個(gè)SNPs位點(diǎn)(rs11614913、rs3746444、rs2910164、rs2292832)，其中rs2910164位點(diǎn)C等位基因和rs2292832位點(diǎn)T等位基因的出現(xiàn)可降低中國人患哮喘的風(fēng)險(xiǎn)。Jimenez-Morales等［48］也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，墨西哥女性哮喘患者rs2910164位點(diǎn)C等位基因的出現(xiàn)伴隨著哮喘發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的降低。rs2910164位點(diǎn)存在于miR-146a的pre-miRNAs的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，其多態(tài)性可能影響 pre-miR-146a加工或者 miR-146a的功能［49］。而miR-146a可通過調(diào)節(jié)白介素1受體相關(guān)激酶 1(Interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK-1)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor，TRAF6)表達(dá)負(fù)反饋調(diào)節(jié)TLR4通路，在哮喘氣道炎癥及氣道重塑過程中具有重要的作用［50］。

3 結(jié)語

雖然miRNAs在哮喘發(fā)病機(jī)制中的研究仍處于起步階段，但是一些miRNAs已經(jīng)被證實(shí)對哮喘的發(fā)病起促進(jìn)或抑制作用，有可能作為未來哮喘治療的靶點(diǎn)?；贚et-7和miR-146類似物的藥物有可能顯著糾正哮喘患者肺部IL-13的過表達(dá)及其他促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，而基于miR-133a類似物的藥物可能修復(fù)ASM細(xì)胞的高反應(yīng)性。相反，利用antimiRs抑制 miRNAs(miR-21、miR-106a、miR-126、miR-145、miR-155、miR-221)的表達(dá)，有可能控制哮喘患者肺部細(xì)胞因子的異常表達(dá)和炎癥的發(fā)生。選擇有效和特異性的miRNAs/anti-miRs，令其有效地進(jìn)入呼吸道及到達(dá)預(yù)定位置后緩慢釋放都是基于miRNAs哮喘藥物的進(jìn)一步研究方向。

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