自噬在厄洛替尼誘導的肺腺癌細胞A549凋亡中的作用

徐 磊 趙 松 黨麗峰 齊 宇 楊 洋 劉東雷 吳 愷 王嘯林 鮑培龍

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院胸外科，河南 鄭州 450052)

表皮生長因子受體(EGFR)是受體酪氨酸激酶(TK)HER/ErbB家族的一個重要成員，在包括肺癌在內的多種惡性腫瘤中均為高表達，并能通過活化下游信號轉導蛋白進而調節(jié)腫瘤細胞的生長、侵襲、轉化、血管生成及轉移〔1〕。研究顯示〔2〕，在抗腫瘤治療過程中EGFR-TKI厄洛替尼可誘導肺癌細胞自噬表達水平上調。自噬是細胞生長發(fā)育、成熟分化及死亡的重要調控機制，與包括腫瘤在內的多種人類疾病有關〔3～7〕。自噬可以促進腫瘤細胞的生存、轉移并增加其耐藥性〔8〕,目前自噬在腫瘤細胞死亡或生存當中的作用仍不清楚。本研究探討自噬在厄洛替尼(Erlotinib)誘導的肺腺癌細胞A549凋亡中的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人肺腺癌細胞株A549由河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室凍存，復蘇后在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d更換1次培養(yǎng)液，用胰酶細胞消化液(含0.25%胰酶和0.02%EDTA)消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。3-甲基腺嘌呤(3-MA)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)為美國Sigma公司產品。厄洛替尼(Erlotinib,商品名:特羅凱)由羅氏公司惠贈，Acridine Orange購于Biotopped公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI1640、不含乙二胺四乙酸(EDTA)胰蛋白酶消化液購自Solarbio公司，AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司生產。Beclin1及半胱氨酸蛋白酶(Caspase9)多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2MTT法檢測細胞抑制率 將對數(shù)生長期A549細胞以1×105個/ml濃度接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，分別加入一系列濃度梯度的3-MA及厄洛替尼，每個濃度設3個復孔，對照組加入等體積的培養(yǎng)液，藥物作用48 h以后每孔加入濃度為5 g/L的MTT 10 μl，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，振蕩10 min，用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度(A)值。細胞生長抑制率=〔1-A實驗組/A對照組〕×100%。

1.3流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數(shù)生長期細胞，調整細胞數(shù)為1×105個/ml，接種于6孔板中，待細胞貼壁后加入相應濃度藥物作用48 h，同時設立陰性對照，離心收集懸浮細胞，用不含EDTA胰蛋白酶消化液消化收集貼壁細胞，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入400 μl AnnexinV結合液懸浮細胞，使細胞濃度約為1×106個/ml，在細胞懸液中加入5 μl AnnexinV-FITC染色液，混勻，4℃避光孵育15 min，再加10 μl PI，混勻，4℃避光孵育5 min，立即上流式細胞儀進行檢測。每組實驗重復3次。

1.4吖啶橙(AO)染色檢測細胞自噬變化 用胰酶消化處于對數(shù)生長期的A549細胞，以1×105個/ml濃度接種于24孔板中，待細胞貼壁后，用實驗濃度的Erlotinib和(或)3-MA處理細胞48 h，同時設立陰性對照組，棄培養(yǎng)液，加終濃度為10 μg/ml的AO室溫避光孵育20 min，棄染液，PBS洗滌3次，用倒置熒光顯微鏡觀察酸性自噬泡的變化情況并攝片。

1.5Western印跡檢測細胞Beclin1和Caspase9蛋白的表達 用一定濃度的藥物處理細胞48 h同時設立陰性對照，用RIPA裂解液裂解細胞，應用考馬斯亮藍，通過測定吸光度值進行蛋白質定量。制備12.5%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，每孔上樣量為100 μg，常規(guī)電泳，半干轉膜法轉膜，5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入Beclin1及Caspase9抗體(工作濃度均為1∶500)4℃孵育過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗滌3次，10 min/次，辣根過氧化物酶標記二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，TBST再次洗滌3次，10 min/次，之后進行增強化學發(fā)光法(ECL)檢測，將結果掃描后用imagej軟件進行灰度分析并進行統(tǒng)計學處理。β-actin為內參照。

2 結 果

2.1MTT檢測結果 對于A549細胞而言，隨著厄洛替尼和3-MA濃度增加細胞生長抑制率增加，厄洛替尼作用48 h時，細胞IC50值約為19.7 μmol/L，因此選用20 μmol/L作為實驗劑量；3-MA作用48 h時，該細胞IC10值約為5 mmol/L,因此選用5 mmol/L作為實驗劑量。

2.2AnnexinV/PI檢測細胞凋亡情況 流式細胞儀檢測示，3-MA組細胞凋亡率為(9.47±0.15)%，與對照組〔(3.51±0.20)%〕相比差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。單用厄洛替尼組細胞凋亡率為(56.35±0.71)%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。厄洛替尼+3-MA組細胞凋亡率明顯增加，為(78.40±0.52)%，與單用厄洛替尼組相比差異顯著(P<0.05)。

2.3AO檢測細胞自噬情況 AO可將胞質內酸性自噬泡染成紅色。單用3-MA組細胞胞核呈均勻綠色熒光，單用厄洛替尼組細胞胞核呈黃綠色熒光，胞質呈點片狀紅色熒光，由此可見該組細胞明顯發(fā)生自噬。3-MA與厄洛替尼聯(lián)合作用組較單用厄洛替尼組細胞相比，紅色熒光強度有所減少。說明3-MA可以抑制厄洛替尼誘導的細胞自噬現(xiàn)象。

2.4Western印跡結果 對照組、厄洛替尼組、3-MA組及厄洛替尼+3-MA組A549細胞Beclin1和Caspase9蛋白相對灰度值分別為0.54±0.03、0.86±0.03、0.37±0.02、0.70±0.04和0.43±0.03、0.77±0.03、0.57±0.04、0.90±0.02，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

肺癌治療目前以手術為主，包括放化療在內的綜合治療方案已經比較成熟，但其預后仍不理想；特別是中晚期失去手術機會的患者，無病生存率更差、更低〔9〕。近年來，以厄洛替尼為代表的靶向治療藥物在臨床上顯示出較好的療效，但后期耐藥又使得醫(yī)生束手無策。有關研究〔10～12〕顯示耐藥的機制與細胞自噬有關。研究發(fā)現(xiàn)，自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有雙重作用。作為腫瘤抑制機制，自噬可以通過誘導細胞死亡或者減少腫瘤細胞的有害突變來防止腫瘤的形成；作為腫瘤保護機制，自噬可以通過保護癌細胞免受放射線的損害和化療藥物的作用來促進腫瘤細胞的生存、轉移并增加其耐藥性。最近的研究表明，厄洛替尼抑制細胞內酪氨酸激酶活性可以誘導自噬〔13～15〕。

本研究結果表明，3-MA可以顯著增強厄洛替尼對肺腺癌A549細胞株的殺傷作用。厄洛替尼可以誘導肺腺癌A549細胞發(fā)生自噬，而3-MA與厄洛替尼聯(lián)合作用則降低了細胞的自噬水平。Caspase9是內源性凋亡通路中的關鍵蛋白酶，是Caspase家族中最重要的起始因子。流式細胞儀及Western印跡檢測結果亦支持以上結論。Beclin1是哺乳動物Atg6的同源基因，一個與Bcl-2相互作用的蛋白，參與自噬泡的形成。結果顯示3-MA組Beclin1表達減少，厄洛替尼組顯著增加，而3-MA與厄洛替尼聯(lián)合作用組較單用厄洛替尼組表達明顯減少。綜合分析以上結果，厄洛替尼可以誘導肺腺癌A549細胞株發(fā)生凋亡，并激活其自噬，而抑制自噬則可能通過激活內源性凋亡通路來增強厄洛替尼的細胞殺傷作用。這些結果表明，自噬抑制劑可以增強厄洛替尼的抗腫瘤作用。因此，聯(lián)合使用自噬抑制劑和酪氨酸激酶抑制劑有可能成為克服臨床上耐藥問題的一個方向，且能增強酪氨酸激酶抑制劑厄洛替尼的效果。

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