胃腸癌nm23H1基因遺傳不穩(wěn)定性及其與臨床病理特性的關(guān)系

劉翠紅 李紅軍

（章丘市中醫(yī)醫(yī)院病理科，山東 章丘 250200）

腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。近些年來，隨著科技的發(fā)展，人們生活水平的不斷提高，但是，科技的發(fā)展造成環(huán)境的惡化，患胃腸癌的患者呈上升趨勢(shì)，惡性腫瘤起病不明顯，微小癌灶的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移難以及時(shí)探查和治療，胃癌嚴(yán)重威脅人類健康和人的生命[1,2]。專家和學(xué)者不斷加深對(duì)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的研究，nm23基因家族的成員之一—— nm23H1基因，作為一種重要的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，nm23基因與胃癌關(guān)系的研究不斷深入，闡明nm23H1基因遺傳不穩(wěn)定性與胃癌、結(jié)腸癌進(jìn)展的關(guān)系，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。對(duì)腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行研究，關(guān)鍵是需要對(duì)可靠的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)的精確建立[3]。在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移主要源于腫瘤細(xì)胞內(nèi)，隨著抑癌蛋白的不斷減少，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移的抑制能力，開始不斷減弱并消失。P53、P16抑癌基因的失活造成了編碼蛋白量的減少。在抑癌基因失活的機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)基因的遺傳不穩(wěn)定性改變，即微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instablility，MSI）和雜合性缺失（loss of heterozygosity，LOH），是基因突變，抑癌基因功能失調(diào)的主要原因，因此腫瘤得以生長(zhǎng)。

1 組織標(biāo)本與方法

人類某些惡性腫瘤如胃癌及結(jié)腸癌等均證實(shí)nm23H1基因表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移或預(yù)后聯(lián)系密切。但至今未見到其是否與胃腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)。胃腸癌在我國(guó)發(fā)生有上升的趨勢(shì)，該病且具有淋巴轉(zhuǎn)移早，預(yù)后不良的特點(diǎn)。

1.1 組織標(biāo)本

標(biāo)本來自我院外科2012年2月至2013年6月胃癌和結(jié)腸癌術(shù)后存檔石蠟標(biāo)本，不計(jì)術(shù)前行放療或化療的患者，共計(jì)35例。其中男性27例，女性8例，年齡22～75歲，平均47.9歲。腫瘤部位：胃癌20例，結(jié)腸癌15例。所有標(biāo)本均再次復(fù)查、確診，35例均為鱗狀細(xì)胞癌，按WHO1971年標(biāo)準(zhǔn)病理分級(jí)：1、2、3級(jí)分別為16、10、9例，臨床分期采用UICC1987年公布的標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為8、9、8、10例。手術(shù)采取切除根治術(shù)，術(shù)后經(jīng)病理確診有腹部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例，占42.9%，術(shù)后失訪2例，隨訪32例中，生存11個(gè)月以上30例，占93.8%，術(shù)后6個(gè)月內(nèi)死亡2例，占6.2%。

1.2 方法

標(biāo)本按4 μm厚連續(xù)切片，分別行nm23H1免疫組化染色及HE染色，免疫組化試劑盒，取米粒大小胃、腸組織，使用美國(guó)Maxim公司基因組DNA提取試劑盒，提取胃、腸組織基因組DNA，-20 ℃冰箱凍存，以說明書內(nèi)容進(jìn)行規(guī)范操作，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。參照王修海等的方法略有改進(jìn)。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，加入等體積變性液（9.8 g/LCAS NO：75-12-7，10 mmol/L NaOH，20 mmol/L EDTA，0.5 g/LCAS NO：115-39-9，0.5 g/LCAS：2650-17-1），加入等體積的蔗糖溶液（100 g/L），混勻后98 ℃變性10 min；迅速置于-20 ℃冰箱10 min；全部上樣于60 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳（丙烯酰胺∶N，N'甲叉雙丙烯酰胺=29∶1），使用TBE工作液（0.5×）：45 mmol/L Tris-硼酸鹽作為電泳緩沖液，它在應(yīng)用前稀釋，并用同一貯存液制備凝膠溶液和電泳緩沖液（pH8.0），恒壓160 V，15 mA，室溫電泳4 h，凝膠用5 g/L AgNO3染色，觀察結(jié)果并照相記錄。

1.3 結(jié)果測(cè)定

棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)，定位在癌細(xì)胞胞質(zhì)中，隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400）計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞比例，陽(yáng)性細(xì)胞＜30%，為低表達(dá)，定為陰性；陽(yáng)性細(xì)胞≥30%為高表達(dá)，定為陽(yáng)性。

1.4 SSCP統(tǒng)計(jì)分析

采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

測(cè)定35例切片中，陽(yáng)性率60%，有21例呈陽(yáng)性表達(dá)。nm23H1基因在癌中的表達(dá)，即陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于胞質(zhì)中，部分胞核、胞膜上亦有表達(dá)。

nm23H1表達(dá)與胃腸癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系：經(jīng)測(cè)定可見，nm23H1表達(dá)與患者性別、年齡及臨床分期關(guān)系并無(wú)明顯表示。但是，隨胃腸癌病理分級(jí)的升高，nm23H1陽(yáng)性率開始有降低的趨勢(shì)，但P＞0.05，即差別并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在腹部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃腸癌組織中，nm23H1陽(yáng)性率分別為52.97%和21.76%，P＜0.05存在顯著差異。術(shù)后生存＞6個(gè)月組中nm23H1陽(yáng)性率（56.27%）較＜6個(gè)月組（18.03%），高出很多，P＜0.05。

3 討論

nm23H1基因早在20世紀(jì)80年代末由美國(guó)國(guó)立癌癥研究所的STEEG等就克隆和鑒定出來了，主要來自小白鼠的不同轉(zhuǎn)移潛能的惡性黑色素瘤細(xì)胞系K1735，其mRNA水平在低轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞，比高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞高10倍之多，將nm23基因?qū)敫咿D(zhuǎn)移鼠黑色素癌細(xì)胞，可以大大降低了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移表型[4,5]。當(dāng)前，nm23位基因缺失現(xiàn)象，普遍存在與人類的乳腺癌、肝癌、胃癌及結(jié)腸癌中，nm23等位基因的缺失與癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移存在較密切的關(guān)系。世界各國(guó)經(jīng)研究一致認(rèn)為nm23基因是最具代表性的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因[6]。

原發(fā)性胃腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，目前有效的治療方法并不明確，患者死亡的重要原因就是腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。近年來通過分子克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)一類參與調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的基因——轉(zhuǎn)移抑制基因。這類基因的失活、突變或表達(dá)異常，可導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。經(jīng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)移抑制基因nm23基因與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系最緊密。nm23基因可以較明確地抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能，但對(duì)nm23基因抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。臨床研究發(fā)現(xiàn)，胃腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與nm23基因缺失或表達(dá)降低關(guān)系密切。對(duì)研究nm23H1基因在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用，主要通過免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)nm23H1，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了mRNA的表達(dá)及NDPK的變化，但對(duì)nm23H1基因突變的研究還在進(jìn)行中。

[1]盧海英,張國(guó)強(qiáng),李繼承.中國(guó)人原發(fā)性膽囊腫瘤nm23H1基因遺傳不穩(wěn)定性的研究[J].分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào),2006,39(3):249-253.

[2]劉義春,王武.抑癌基因nm23H1與腫瘤轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生,2010,48(22):12-13.

[3]康向東,張隆,吳蓉,等.阻抑素在胃腸癌中的表達(dá)情況及其臨床意義[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2006,21(6):610-612.

[4]王軼淳,孫明軍,傅寶玉.胃癌組織中β-catenin及nm23H1的表達(dá)及其臨床意義[J].世界華人消化雜志,2007,15(19):2144-2147.

[5]朱大興,周清華,王艷萍,等.利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建突變nm23H1和EGFP融合基因[J].中國(guó)肺癌雜志,2006,9(2):117.

[6]Liu YB,Gao SL,Chen XP,et al.Expression and significance of heparanase and nm23H1 in hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2005,11(9):3392-3397.