抗菌肽在水產(chǎn)動物飼料中的應(yīng)用研究進(jìn)展

于世亮，王裕玉，徐中玉，石 野，車建芳，楊雨虹＊

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

抗菌肽，又稱抗微生物肽、抗生素肽，是一種具有廣譜抗微生物活性的小分子多肽，是生物體先天非特異性防御系統(tǒng)的重要組成部分 （廣慧娟等，2012；姜珊等，2011）?？咕牟粌H對革蘭氏陽性菌、陰性菌有抑制作用，還能抑制或殺滅真菌、霉菌、原蟲和部分有包膜病毒等。這類活性多肽具有免疫原性小、熱穩(wěn)定性好、水溶性好、抗菌譜廣等優(yōu)點。已有研究表明，在動物日糧中添加抗菌肽能夠提高動物的生產(chǎn)性能和飼料利用率、改善動物腸道微生態(tài)環(huán)境、提高動物的免疫機(jī)能與抗病力（單安山等，2012）。此外，在飼料中添加抗菌肽，可以解決大量抗生素的使用導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生耐藥性的問題。本文就抗菌肽的分類、作用機(jī)理及其在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用作一綜述。

1 抗菌肽的分類

抗菌肽在自然界分布廣泛，種類繁多。目前已經(jīng)從細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲、兩棲類動物、魚類、鳥類、哺乳類動物和人體中發(fā)現(xiàn)并分離2000多種具有抗菌活性的多肽。根據(jù)其來源可分為昆蟲抗菌肽，如昆蟲防御素（Insect defensins）、天蠶素（Cecropins）等；哺乳動物抗菌肽，如 α-防御素、β-防御素和θ-防御素等；水產(chǎn)動物抗菌肽，如貽貝肽（Myticins）、貽貝素（Mytilins）、魚類鐵調(diào)素（Hepcidin）等；兩棲類抗菌肽，如蛙肽、爪蛙肽等；植物抗菌肽，如硫素 （Thionin）、脂轉(zhuǎn)移蛋白（Lipid transfer proteins）等；微生物抗菌肽，如桿菌肽（Bacitracin）類等；人工抗菌肽，如合成抗菌肽、基因工程抗菌肽等。

根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為帶有α-螺旋結(jié)構(gòu)的線性抗菌肽，如天蠶素、爪蟾抗菌肽；β-折疊、富含半胱氨酸、二硫鍵的抗菌肽，如植物防御素、昆蟲防御素、α和β防御素；具有環(huán)形結(jié)構(gòu)的抗菌肽，如subtilosin A；富含甘氨酸、脯氨酸的線性抗菌肽，如holotricinⅡ、formaecins、abaecins。到目前為止，抗菌肽的分類存在較大爭議，但普遍認(rèn)同的分類方法是依據(jù)抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類（Smith等，2010）。

2 抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點

抗菌肽的相對分子質(zhì)量較小，是由20～60個氨基酸殘基組成的序列高度保守的短肽，其一級結(jié)構(gòu)相似?？咕牡陌被酦端富含賴氨酸和精氨酸等親水的堿性氨基酸，中間連接部分的結(jié)構(gòu)則易于插入細(xì)胞膜，而C端富含甘氨酸或脯氨酸等疏水氨基酸，常被酰胺化（柳江楓等，2012）。大多數(shù)抗菌肽的一級結(jié)構(gòu)中的特定位置有一些較保守的氨基酸殘基，例如，第2、5、11位氨基酸殘基為色氨酸、賴氨酸、天冬氨酸等，這些保守的氨基酸殘基保證了抗菌肽分子的抗菌活性（Boman等，1985）。此外，大多抗菌肽的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，不易被胰蛋白酶、胃蛋白酶水解（黎觀紅等，2011；王典等，2010）。

抗菌肽的功能主要決定于其高級結(jié)構(gòu)。在一定條件下，抗菌肽可形成α-螺旋、β-折疊、環(huán)狀結(jié)構(gòu)和伸展性結(jié)構(gòu)4種二級結(jié)構(gòu)?？咕牡母呒壗Y(jié)構(gòu)與抗菌活性的關(guān)系為其分子改造和設(shè)計提供了理論依據(jù)，很多研究人員通過氨基酸替換、增強(qiáng)螺旋度、構(gòu)建雜合肽等多種方式來獲得抗菌活性更強(qiáng)，抗菌譜更廣的新型抗菌肽。

3 抗菌肽的作用機(jī)理

國內(nèi)外學(xué)者對抗菌肽的可能抗菌機(jī)制進(jìn)行了大量研究，目前較為統(tǒng)一的觀點是將抗菌肽的抗菌機(jī)制總體上概括為膜結(jié)構(gòu)破壞模式和非膜結(jié)構(gòu)破壞模式兩種方式。

3.1 膜結(jié)構(gòu)破壞模式 抗菌肽通過與細(xì)胞膜作用，使膜蛋白凝聚、失活，形成離子通道，引起膜通透性改變，最后導(dǎo)致細(xì)菌死亡?？咕牡臍饔靡蕾囉诙嚯暮图?xì)菌表面初始的引力，隨后抗菌肽與細(xì)胞質(zhì)膜相互作用，這一引力很大程度上是帶正電荷的多肽和帶負(fù)電荷的細(xì)菌細(xì)胞壁之間的靜電作用（Huang，2000；Shai等，1999）。 也有研究認(rèn)為，抗菌肽是通過與細(xì)胞膜上存在的特異性受體及其他因子協(xié)同作用而導(dǎo)致細(xì)菌死亡的，即胞內(nèi)損傷機(jī)理。此模式機(jī)制包括三種模型，分別為桶板模型（Barrel-stave model）、環(huán)孔模型（Toroidal pore model）和地毯模型（Carpet models）。

桶板模型指抗菌肽通過靜電作用吸附到細(xì)胞膜表面，多個抗菌肽螺旋在細(xì)胞膜表面聚集形成中空的螺旋束結(jié)構(gòu)，其中疏水性氨基酸殘基排列在螺旋束的外側(cè)與磷脂雙層相互作用，親水基團(tuán)排列在螺旋束內(nèi)側(cè)，桶板模型中抗菌肽形成跨膜孔洞，質(zhì)膜完整性遭破壞，細(xì)胞膜內(nèi)部分子通過孔洞滲透到胞外，進(jìn)而實現(xiàn)抑菌作用 （Yang等，2001）。這一模式僅在少數(shù)抗菌肽 （如真菌alamethicin）中得到證實。

環(huán)形孔模型即跨膜孔模式，指抗菌肽插入到細(xì)胞膜內(nèi)誘導(dǎo)脂質(zhì)單層不斷彎曲，水分子嵌入，在環(huán)孔形成過程中，抗菌肽極性基團(tuán)與脂質(zhì)極性基團(tuán)相互作用，脂質(zhì)在正常片層結(jié)構(gòu)上傾斜，最終連接到細(xì)胞膜兩側(cè)片層結(jié)構(gòu)，在環(huán)孔形成中不斷彎曲，最后形成跨膜環(huán)孔（Yamaguchi等，2001）。 該模式與桶板模型區(qū)別在于：該模型中即使抗菌肽垂直嵌入到質(zhì)膜雙層上，抗菌肽也總是與脂質(zhì)的頭部相互作用。

地毯模型是指抗菌肽依靠靜電吸附與細(xì)胞膜上陰離子型磷脂頭部基團(tuán)相互作用，然后在質(zhì)膜表面積累并平行排列，像地毯一樣覆蓋在質(zhì)膜表面。當(dāng)濃度逐漸增大到臨界值時，抗菌肽像去污劑一樣裂解細(xì)胞膜形成膠團(tuán)狀物質(zhì)。在臨界值濃度下，抗菌肽在細(xì)胞膜上形成暫時性環(huán)孔，抗菌肽通過環(huán)孔進(jìn)入到質(zhì)膜內(nèi)部，由于質(zhì)膜雙層結(jié)構(gòu)遭破壞導(dǎo)致了膜不完整性和微膠團(tuán)物形成，從而達(dá)到殺菌的目的。蛾血淋巴中的抗菌肽cecropin A以及富含色氨酸的抗菌肽indolicidin等均是利用此種機(jī)制來破壞細(xì)胞膜的（單安山等，2012）。

3.2 非膜結(jié)構(gòu)破壞模式 少數(shù)抗菌肽，如馬蹄蟹體內(nèi)的抗菌肽Tachyplesins能在不引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞的情況下快速穿膜，抗菌肽需要先通過靜電作用與細(xì)菌胞膜相互吸引而結(jié)合?？咕拇┩纲|(zhì)膜后在胞內(nèi)累積，通過與胞內(nèi)靶位點特異性結(jié)合抑制DNA復(fù)制、RNA合成、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂、胞內(nèi)物質(zhì)代謝以及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程，從而達(dá)到抑制、殺滅細(xì)菌的目的（王興順等，2012；Hirakura 等，2002）。

此外，抗菌肽還可以通過其他的方式產(chǎn)生抗菌效果，包括抑制細(xì)胞的呼吸作用、抑制細(xì)胞壁形成、抑制蛋白質(zhì)或核酸的合成等，某些富含脯氨酸的抗菌肽還可與細(xì)菌的熱休克蛋白結(jié)合而發(fā)揮抗菌活性。

4 抗菌肽在水產(chǎn)動物生產(chǎn)中的應(yīng)用

4.1 提高成活率 抗菌肽作為飼料添加劑對細(xì)菌具有明顯的抑制作用。Zasloff（2002）對斑節(jié)對蝦的研究結(jié)果顯示，飼料中添加抗菌肽Mytilin可以顯著提高其成活率及抗白斑病毒感染能力。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加抗菌肽可以顯著提高凡納濱對蝦（宋理平等，2010）和南美白對蝦（王廣軍等，2005）的抗病能力。黃滄海等（2009）研究表明，抗菌肽能顯著提高羅非魚幼魚抑菌作用。Chiou等（2009）研究報道，重組抗菌肽Chelonianin可以有效地控制感染哈氏弧菌羅非魚的炎癥發(fā)生并能降低其死亡率。姜珊等（2011）對飼喂抗菌肽的羅非魚進(jìn)行嗜水氣單胞菌的攻毒試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加量為5～20 mg/kg時，嗜水氣單胞菌攻毒后的死亡率顯著降低，證明攝食抗菌肽可以顯著提高羅非魚的抗病能力，可能是由于抗菌肽在魚體內(nèi)直接發(fā)揮殺菌的作用，也可能與抗菌肽提高了抗氧化酶與溶菌酶的活力有關(guān)。但高劑量抗菌肽卻未能顯著提高羅非魚的成活率，可能是因為高劑量抗菌肽破壞了腸道菌群平衡，在殺滅腸道有害菌的同時破壞了有益菌的生長環(huán)境，也可能與免疫相關(guān)酶類的活性降低有關(guān)。

4.2 提高生產(chǎn)性能 在飼料中添加抗菌肽，可提高飼料利用率，促進(jìn)水產(chǎn)動物生長。李曉穎等（2013）用20%、40%、60%富含抗菌肽乳酸菌發(fā)酵豆粕替代 （56.0±0.56）g羅非魚飼料中的魚粉，結(jié)果顯示，20%組羅非魚增重率、飼料系數(shù)與對照組差異不顯著，但均顯著高于40%組和60%組。宋理平等（2010）研究表明，在（0.10±0.01）g 凡納濱對蝦飼料中添加10g/kg重組抗菌肽制劑后，對蝦成活率提高8.41%，相對增重率提高27.60%。陳冰等（2010）在（0.86±0.01）g 凡納濱對蝦飼料中添加 0 ～5000 mg/kg家蠅抗菌肽提取物，結(jié)果顯示，當(dāng)抗菌肽提取物添加量為2000～3000 mg/kg時，對蝦成活率、增重率、特定生長率、飼料效率顯著高于對照組。柴仙琦等（2012）報道，飼料中添加300 mg/kg抗菌肽后，凡納濱對蝦的增重率提高8.76%，飼料系數(shù)降低12.5%，而400 mg/kg和500 mg/kg組與對照組相比較差異不顯著。姜珊等（2011）研究結(jié)果顯示，飼料中添加5～10 mg/kg抗菌肽可以顯著提高羅非魚的終、末體質(zhì)量和增重率。由此可見，在飼料中添加適量抗菌肽對水產(chǎn)動物有促生長作用，可能是因為抗菌肽抑制腸道有害微生物，促進(jìn)腸道微生物菌群平衡，進(jìn)而產(chǎn)生促生長的作用。但抗菌肽添加過量會導(dǎo)致凡納濱對蝦（柴仙琦等，2012；陳冰等，2010）和羅非魚（姜珊等，2011）增重率降低，這可能是因為高劑量抗菌肽會抑制腸道中有益菌群的生長，影響動物體的消化吸收。

4.3 改善免疫功能 當(dāng)動物體受到細(xì)菌、真菌和病毒等病原微生物入侵時，抗菌肽作為免疫效應(yīng)分子來啟動、調(diào)節(jié)宿主免疫防御體系，從而促進(jìn)免疫功能以消除感染，保護(hù)宿主免受病原微生物侵害（周洪波等，2009）。宋理平等（2010）研究了抗菌肽對凡納濱對蝦非特異性免疫的影響，結(jié)果表明，與對照組相比，飼料中添加10 g/kg抗菌肽后，總抗氧化能力顯著提高，而對溶菌酶活性和超氧化物歧化酶活性影響均不顯著；水浴攻毒后，超氧化物歧化酶活性提高77.40%，總抗氧化能力提高453.16%。柴仙琦等（2012）研究報道，在凡納濱對蝦飼料中添加抗菌肽后，可顯著提高血清非特異性免疫功能。陳冰等（2010）研究飼喂不同水平抗菌肽提取物對凡納濱對蝦血細(xì)胞數(shù)、吞噬率和免疫相關(guān)酶活性的影響，結(jié)果表明，與對照組相比，添加2000～5000 mg/kg抗菌肽提取物可顯著提高對蝦血細(xì)胞數(shù)量；2000～4000 mg/kg組對蝦血細(xì)胞吞噬率顯著提高。添加量為2000～3000 mg/kg時，對蝦血清中酚氧化酶、過氧化物酶、堿性磷酸酶、溶菌酶的活性和總抗氧化能力均維持在一個較高的水平，且顯著高于對照組，與對照組相比較，3000 mg/kg組溶菌酶的活性提高1.6倍。王一娟等（2011）研究表明，在河蟹飼料中添加0.4%抗菌肽可以顯著提高肝臟、肌肉組織中超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力，顯著降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、球蛋白及肝臟、肌肉、性腺中丙二醛濃度。李曉穎等（2013）的研究指出，對照組和20%組羅非魚血清中溶菌酶的含量在整個試驗過程中均呈上升趨勢，而40%組和60%組的含量呈逐漸下降的趨勢。姜珊等（2011）研究結(jié)果顯示，飼料中添加5～10 mg/kg抗菌肽可以顯著提高羅非魚紅細(xì)胞總數(shù)、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性，說明適量地添加抗菌肽可以提高機(jī)體抗氧化酶活力。然而，當(dāng)添加量為50mg/kg時，肝臟的超氧化物歧化酶與血清中溶菌酶活性顯著低于對照組，可能是因為抗菌肽添加量過高時，毒性太強(qiáng)，破壞了肝臟的組織結(jié)構(gòu)與血液組分，導(dǎo)致酶活性下降。

4.4 改善產(chǎn)品品質(zhì) 對蛋雞 （呂尊周等，2012）、蘆花雞（郭麗君等，2012）、奶牛（徐名能等，2011）的研究指出，日糧中添加抗菌肽制劑能改善動物產(chǎn)品品質(zhì)，但關(guān)于抗菌肽對水產(chǎn)品品質(zhì)影響的研究還未見報道，有待于進(jìn)一步的研究。

5 小結(jié)

綜上所述將抗菌肽添加到水產(chǎn)飼料中，不僅可以提高生產(chǎn)性能、魚體的免疫力，而且可以提高水產(chǎn)品質(zhì)量，是一類極具發(fā)展前景的新型抗微生物制劑。對于抗菌肽作為飼料添加劑的可行性雖然已經(jīng)有了一定的進(jìn)展，但并不深入，還需要更深入和更系統(tǒng)的研究：（1）構(gòu)建基因工程菌，提高其表達(dá)量，改進(jìn)分離和純化技術(shù)。（2）研究抗菌肽的免疫原性、安全性、藥理學(xué)、毒理學(xué)、藥代動力學(xué)及其作用機(jī)制等。（3）由于易被動物體內(nèi)的蛋白酶降解，需要在不影響其抗菌活性的基礎(chǔ)上，提高其體內(nèi)穩(wěn)定性。（4）其對動物細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性，在保持其結(jié)構(gòu)與活性的同時，降低其細(xì)胞毒性。相信隨著分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)在抗菌肽研究與開發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用，這些問題將逐步得到解決，抗菌肽將對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展將起到重要的作用。

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