結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)研究進展

朱 彬，張萬江

近年來隨著人口的增長和流動、與HIV的伴發(fā)感染、卡介苗免疫效率的不穩(wěn)定、以及耐藥性菌株的日益增多，全球結(jié)核病疫情再度回升。尤其是耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant TB，MDR-TB)、廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant TB，XDR-TB)，以及全耐藥結(jié)核病(totally drug-resistant TB，TDR-TB)的出現(xiàn)，給結(jié)核病的的防控工作造成了巨大的壓力[1]。結(jié)核病的耐藥機制除了與藥物因素引起結(jié)核分枝桿菌染色體上某些基因的突變等有關外，還與非藥物因素有關，如結(jié)核分枝桿菌的滯留特性、主動外排系統(tǒng)的功能、宿主體內(nèi)復雜的微環(huán)境等；即非藥物因素也是導致結(jié)核分枝桿菌耐藥發(fā)生的重要原因。

蛋白酶體途徑是真核細胞中除溶酶體外降解蛋白質(zhì)的又一主要途徑。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)都要先被泛素標記，進一步被多泛素化，而后被19S調(diào)節(jié)顆粒識別，再將其導入蛋白酶體降解[2-3]。2008年，Pearce等在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)中發(fā)現(xiàn)了與真核細胞中的泛素功能相似的蛋白質(zhì)，命名為原核類泛素蛋白(prokaryotic ubiquitin-like，Pup)[4]。結(jié)核分枝桿菌Pup與結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體組成了結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)(Pup-poroteasome system，PPS)。在PPS中，Pup可以在輔助因子的作用下標記多種功能蛋白，并介導被標記蛋白質(zhì)通過蛋白酶體降解。在結(jié)核分枝桿菌中，Pup - 蛋白酶體系統(tǒng)有助于致病細菌宿主巨噬細胞內(nèi)的持久性支持[5]。PPS的發(fā)現(xiàn)揭示了原核生物中一個嶄新的蛋白質(zhì)降解機制，對PPS降解蛋白質(zhì)途徑的作用機理和生理功能的研究已成為當前病原菌研究的熱點。對PPS的研究有望找到更有效的抗結(jié)核藥物作用的靶點。為此，本文對結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體的研究進展做如下綜述。

1 Pup-蛋白酶體系統(tǒng)結(jié)構(gòu)

1.1Pup的結(jié)構(gòu)特點 結(jié)核分枝桿菌中的Pup是一個由64個氨基酸組成的C-末端區(qū)域呈螺旋狀的內(nèi)部結(jié)構(gòu)混亂的無序蛋白，可以對結(jié)核分枝桿菌待降解的蛋白質(zhì)進行識別和修飾，然后將其導入結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體進行降解[4]。Pup含有獨特的區(qū)域與Pupulation酶(Pupulation enzymes)相互作用，并引發(fā)底物蛋白的蛋白酶體降解，其螺旋狀C-末端介導其與底物蛋白質(zhì)的連接，而其氨基末端則對于其降解功能的發(fā)揮至關重要[6]。雖然Pup與真核生物中各種泛素樣蛋白質(zhì)序列相比相似性很低，但它們的三維結(jié)構(gòu)卻高度保守，都呈現(xiàn)典型的類泛素折疊模式。盡管Pup與泛素在序列和對蛋白底物的靶向連接過程等方面存在一些差異，但兩者在介導蛋白底物的蛋白酶體靶向降解方面所發(fā)揮的作用是相似的[7-8]。Pup是一種無序蛋白(inrrinsically disordered protein，IDP)，其結(jié)構(gòu)為不穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)[9]；Pup標記蛋白質(zhì)后其N端仍保持無序狀態(tài)，C端S21-K61形成螺旋結(jié)構(gòu)，能與Mpa(mycobacterial proteasome ATPase)的N端螺旋結(jié)構(gòu)域非共價作用，可被Mpa傳遞入蛋白酶體進行降解[10-11]；因此Pup可能具有兩種功能，它不僅是讓底物成為蛋白酶體識別的標記物，而且使靶蛋白帶上無序標簽，有利于靶蛋白的降解[6]。

1.2蛋白酶體的結(jié)構(gòu)特點 結(jié)核分枝桿菌的蛋白酶體為750 kDa，其結(jié)構(gòu)與真核生物的蛋白酶體結(jié)構(gòu)相似，呈桶狀結(jié)構(gòu)，包含由α亞基形成的2個7元外環(huán)和β亞基形成的2個7元內(nèi)環(huán)。蛋白水解發(fā)生在β亞基N-末端的蘇氨酸上。真核生物蛋白酶體含有7種α亞基和7種β亞基，其中只有3種β亞基(β1、β2、β5)具有蛋白水解活性。而原核生物蛋白酶體則通常只含有1種或2種類型的α和β亞基，其中結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的β亞基為單一的類型，并且14個β亞基中的每一個均提供1個N末端蘇氨酸的活性位點[12]。冷凍電鏡技術(shù)顯示：結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的核心顆粒具有1個閉合的尾部，這個結(jié)果與負染色電鏡技術(shù)所顯示的密度測定結(jié)果是一致的。α-亞基N-末端八倍體的存在進一步提示結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體含有1個門控式結(jié)構(gòu)[13]。真核生物蛋白酶體的核心顆?？赏ㄟ^7個α亞基的不同氨基末端肽關閉其蛋白底物的入口，而結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的晶體結(jié)構(gòu)則提示其核心顆粒的門控是被7個相同的肽通過3種不同的構(gòu)象緊緊密封的[3]。

2 結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)介導的蛋白質(zhì)的降解過程

Mtb中Pup-蛋白酶體系統(tǒng)介導的蛋白質(zhì)降解過程與真核生物中的泛素化過程類似，Mtb中的Pup通過pupylation反應后使底物蛋白被標記上Pup并隨之被蛋白酶體降解。pupylation過程類似于泛素化，但其酶學反應過程與泛素化過程不盡相同。近幾年研究證明，利用結(jié)核桿分枝菌pupylation途徑，可以幫助克服其宿主的免疫防御，使結(jié)核分枝桿菌在宿主內(nèi)生存[14]。pupylation過程包括1個獨立的脫酰胺作用和1個接合反應，分別通過Pup的去酰胺 (Dop)和Pup連接酶PafA來催化：Pup C端Gln在去酰胺酶Dop催化下形成Glu；在PafA 連接酶的作用下，通過水解ATP，使Pup C端Glu磷酸化，并催化其以共價鍵的形式與底物蛋白上的Lys連接；Pup標記的蛋白質(zhì)通過Pup C端與Mpa N端相互作用，Mpa水解ATP 打開蛋白酶體核心區(qū)域的門(α亞基)，傳遞底物蛋白到蛋白酶體的核心區(qū)域，同時Dop促使去Pup化，使Pup重復利用；底物經(jīng)由蛋白酶體被降解。

3 結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)中輔助因子與致病性的關系

在真核生物當中，泛素所介導的蛋白質(zhì)降解需要泛素活化酶E1，泛素偶聯(lián)酶E2，特異性識別蛋白底物的泛素連接酶E3，ATP酶及許多調(diào)節(jié)亞基等一系列輔助因子來參與調(diào)節(jié)，這些輔助因子參與靶蛋白的泛素化和去泛素化過程，來調(diào)控細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解。原核生物中Pup-蛋白酶體系統(tǒng)介導的蛋白質(zhì)降解也需要輔助因子，目前已知的輔助因子有Mpa(mycobacterial proteasome ATPase)、 Dop (deamidase of Pup) 和PafA (proteasome accessory factor A)。在對NO 敏感的結(jié)核分枝桿菌的研究過程中發(fā)現(xiàn)，多個與蛋白酶體相關的基因突變后會導致結(jié)核分枝桿菌對NO敏感，導致結(jié)核分枝桿菌存活率顯著降低，這說明蛋白酶體的相關基因在結(jié)核分枝桿菌的致病過程中發(fā)揮著極其重要的作用[13]。

Mpa：1998年，Wolf 等發(fā)現(xiàn)，放線菌中蛋白酶體基因的上游基因Rv2115c 可編碼具有ATP 水解功能的蛋白質(zhì)[15]；與真核生物中蛋白酶體19S 調(diào)節(jié)顆粒中的ATP 酶具有同源性，且兩者的功能相似，即參與調(diào)節(jié)蛋白酶體α亞基“門”的開關；同時，Mpa 自身是原核蛋白酶體的底物，表明原核蛋白酶體可以通過對Mpa 的降解進行自我功能的反饋調(diào)節(jié)，結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體功能與此相似。研究表明，當Mpa基因缺失或突變時，蛋白酶體對結(jié)核分枝桿菌的保護能力大大降低，而且結(jié)核分枝桿菌菌株的毒力也減弱了[16-17]；導致結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)和體外的生長速率減慢，結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的殺傷力減弱[18]。

連接酶PafA：由結(jié)核分枝桿菌 Rv2097c 基因編碼，與γ-谷氨酰半胱氨酸具有同源性，是一個依賴于ATP的羧氨連接酶。研究表明，PafA是蛋白酶體底物保持穩(wěn)定水平的關鍵[19]；當PafA基因突變或者是缺失時，可導致結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體系統(tǒng)抗活性氮中間體(RNI)的能力減弱；而一氧化氮(NO)和其他活性氮中間體(RNI)的產(chǎn)生，有助于控制感染的結(jié)核分枝桿菌，而結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的輔助因子可保護結(jié)核分枝桿菌不受NO和RNI的損傷[20]。 Cerda-Maira和Festa等[19，21]發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌PafA基因的突變可以造成底物蛋白的積累，同時檢測不到Pup標記蛋白的存在，說明PafA對于Pup與靶蛋白連接是必需的，對于蛋白酶體降解底物蛋白過程中不可或缺的部分。

去酰胺酶Dop：Dop 蛋白由Rv2112c 基因編碼，其氨基酸序列與真核生物蛋白酶體系統(tǒng)中的E1、E2 和E3 沒有同源性，但與羧氨連接酶具有一定同源性[22]。Pup 蛋白C端序列為Gly-Gly-Gln，Dop的N端可以催化去酰胺化反應，將Pup C端的Gln轉(zhuǎn)變?yōu)镚lu。Imkamp等[23]通過敲除恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis，Msm)菌株Dop基因構(gòu)建了Dop缺失突變株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的Pup化在Msm中不能進行，致使造成底物蛋白的大量積累。又將Dop基因重新植入Dop缺失突變株中，蛋白質(zhì)的Pup化恢復正常，此研究表明Dop催化的去酰胺化反應對Pup與靶蛋白的共價連接是必需的。2010 年Burns和Imkamp等[24-25]發(fā)現(xiàn)，Dop不但具有蛋白質(zhì)的Pup化功能，還具有去Pup化功能，在Dop的作用下被Pup標記的底物蛋白FabD、Ino1和PanB可以被去Pup化，產(chǎn)生游離的Pup，這一去Pup過程依賴于Mpa的存在。

由此證明，結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的輔助因子和結(jié)核分枝桿菌的致病性及在宿主細胞的持留有密切關系。

4 結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)底物蛋白與致病性的關系

實驗證實，在結(jié)核分枝桿菌中，能被Pup標記且被蛋白酶體降解的底物蛋白有FabD、PanB、Ino1、Icl、SodA、MtrA等，這些底物蛋白各自具有重要的生物學功能，同時與結(jié)核分枝桿菌的致病性和在宿主細胞的持留具有密切關系[8，26]。如丙二酰乙酰輔酶A轉(zhuǎn)酰酶FabD在結(jié)核分枝桿菌內(nèi)是催化脂肪酸合成的重要酶，而結(jié)核分枝桿菌的細胞壁含有大量脂肪酸，增加其對外界復雜環(huán)境的抵抗力，它和結(jié)核分枝桿菌逃逸免疫系統(tǒng)攻擊的能力、結(jié)核分枝桿菌的毒力息息相關；與結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病機制有密切關系[16，27]。酮脂酰羥甲基轉(zhuǎn)移酶PanB參與結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)泛酸的生物合成，而泛酸與乙酰輔酶A的合成有關，乙酰輔酶A參與脂肪酸代謝和TCA循環(huán)[15，28]。磷酸肌醇合酶Ino1對結(jié)核分枝桿菌的硫醇和細胞壁脂聚糖的形成有重要作用，Movahedzadeh[29]等構(gòu)建了缺乏基因編碼Ino1的結(jié)核分枝桿菌突變體，結(jié)果顯示結(jié)核分枝桿菌的Ino1突變體很難在巨噬細胞和小鼠體內(nèi)長期生存。另一個重要的底物蛋白異檸檬酸裂解酶Icl，該酶是乙醛酸循環(huán)途徑中的關鍵酶，它的催化作用是為在醋酸鹽或含有某些脂肪酸的培養(yǎng)基上生長的結(jié)核分枝桿菌提供了碳源。正常體外培養(yǎng)條件下，Icl被降解，在體外缺氧條件下Icl的表達升高；Icl的缺失在感染急性期并不影響結(jié)核分枝桿菌的生長，但巨噬細胞的生存明顯減弱，降低了結(jié)核分枝桿菌的持留能力和致病性[30-31]。過氧化物岐化酶SodA，高致病性的結(jié)核分枝桿菌中過氧化物岐化酶SodA的表達水平比非致病性的結(jié)核分枝桿菌高93倍[32]；說明SodA與結(jié)核分枝桿菌的致病性密切相關，可能參與抗宿主免疫作用。結(jié)核分枝桿菌反應調(diào)節(jié)器MtrA緊密聯(lián)系著細菌的清除，當結(jié)核分枝桿菌感染小鼠或巨噬細胞后，高表達的MtrA可以加速結(jié)核分枝桿菌的清除，但在體外培養(yǎng)基中高表達的MtrA不影響結(jié)核分枝桿菌菌株的正常生長[33]。由此說明，上述底物蛋白和結(jié)核分枝桿菌的致病性均有密切關系，蛋白酶體通過對這些蛋白的調(diào)控，使結(jié)核分枝桿菌能夠在各種復雜的環(huán)境下維持其生理功能并致病。在不同的生長環(huán)境下Pup會選擇性標記不同的蛋白，鑒于這些結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)底物蛋白的生理功能，結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)可以通過調(diào)控蛋白質(zhì)降解在結(jié)核分枝桿菌的生長調(diào)控和致病性中發(fā)揮重要作用。

5 結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體抑制劑與致病性的關系

結(jié)核分枝桿菌的蛋白酶體是一些蛋白降解所必需的成分[9]，對于在小鼠體內(nèi)的持留[7]以及對體外氮氧化物壓力下結(jié)核分枝桿菌的存活[34]都起到至關重要的作用。有研究證實蛋白酶體可作為新型藥物的作用靶標[8]；而近期研究發(fā)現(xiàn)了化合物oxathiazol-2-one和天然物質(zhì)Fellutamide B，兩者都具有抑制結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的功能。oxathiazol-2-one可以在不損傷細胞情況下有效的抑制結(jié)核分枝桿菌中蛋白酶體的功能，而且是不可逆的[35]；在對oxathiazol-2-one的結(jié)構(gòu)分析時發(fā)現(xiàn)該抑制劑是直接通過改變結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體的蛋白水解酶活性位點來阻斷其降解蛋白質(zhì)功能的[36]。Fellutamide B是迄今為止最有力的結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體抑制劑； 研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ellutamide B在不但可以抑制結(jié)核分枝桿菌20S，而且同時可以抑制蛋白酶體；結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體絡合時，F(xiàn)ellutamide B疏水尾部的部分的靈活性表明，尾部較短，可能會進一步提高其對結(jié)核分枝桿菌蛋白酶體功能的約束力[37]。如果蛋白酶體抑制劑發(fā)揮作用，蛋白酶體的功能受到限制，Pup標記的底物逐漸累積，導致基因表達的間接改變，將會大幅度減弱結(jié)核分枝桿菌抗外界的壓力和其致病性的能力。最近研究證實，抑制劑可以有效對抗多種有毒力的廣泛耐藥的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株[38]。而且能穿透結(jié)核分枝桿菌并在硝化應激反應下殺死非復制的結(jié)核分枝桿菌[39]。這也進一步說明蛋白酶體抑制劑可以通過抑制蛋白酶體的功能來降低結(jié)核分枝桿菌的致病性。

6 展 望

迄今為止，對結(jié)核病的發(fā)病機制的研究尚處在探索階段。結(jié)核病的防治仍面臨著巨大的困難。結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)與結(jié)核分枝桿菌的致病性密切相關，但對于結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的研究還處于初步階段，仍需要大量的研究來進一步揭示結(jié)核分枝桿菌Pup-蛋白酶體系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌致病過程中的作用和機制。Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的研究為結(jié)核分枝桿菌致病機制的研究提供新的方向，對Pup標記的底物蛋白和蛋白酶體抑制劑的研究，都將有可能成為抗結(jié)核病的新的藥物靶標。尋找新的更有效的抗結(jié)核藥物作用靶點對于結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的治療已刻不容緩。深刻認識 Pup-蛋白酶體系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制為結(jié)核病的發(fā)病機制的研究提供了新的方向。

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