蛋白質(zhì)組學(xué)在肥胖和胰島素抵抗及2型糖尿病中的應(yīng)用研究進(jìn)展

王銘婕，閆朝麗

肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病作為糖尿病發(fā)生的三步曲，關(guān)系十分緊密。目前得到大家認(rèn)可的蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)運(yùn)用在動物細(xì)胞、組織成為一種新興的技術(shù)手段，而應(yīng)用于肥胖、胰島素抵抗和糖尿病患者的血清、組織細(xì)胞甚至唾液和尿液的蛋白質(zhì)相關(guān)分析更加直觀，臨床指導(dǎo)作用更強(qiáng)。進(jìn)一步在蛋白水平上揭示肥胖、胰島素抵抗及2型糖尿病之間的關(guān)系，為解釋疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制、預(yù)防和診斷2型糖尿病以及糖尿病相關(guān)藥物的開發(fā)提供思路。本文就蛋白質(zhì)組學(xué)在肥胖、胰島素抵抗及2型糖尿病中的應(yīng)用及進(jìn)展作一綜述。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)概述

蛋白質(zhì)組(proteome)的概念首先由澳大利亞學(xué)者Wilkins等于1994年首次提出，源于蛋白質(zhì)(protein)和基因組的(genome)的整合，指一個(gè)細(xì)胞內(nèi)存在的全部蛋白質(zhì)[1]。蛋白質(zhì)組本質(zhì)上指的是在大規(guī)模水平上研究蛋白質(zhì)的特征，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用等，由此整體而全面地認(rèn)識蛋白質(zhì)水平上關(guān)于疾病發(fā)生發(fā)展的過程。目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究較多使用雙向電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)和質(zhì)譜法(mass spectrometry，MS)。

2-DE是等電聚焦電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳(按照pI分離)，然后再進(jìn)行SDS-PAGE(按照分子大小)，經(jīng)染色得到的電泳圖是個(gè)二維分布的蛋白質(zhì)圖。MS即用電場和磁場將運(yùn)動的離子按質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測的方法，目前多用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)，主要用于對生物大分子物質(zhì)和有機(jī)小分子化合物分子量的測定以及對蛋白質(zhì)進(jìn)行高通量的鑒定。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用

蛋白質(zhì)組學(xué)作為大規(guī)模水平上蛋白質(zhì)篩查的方法，可鑒定出大量蛋白質(zhì)，但是目前對其中的一部分蛋白質(zhì)認(rèn)識甚少，還需要在確定其種類的基礎(chǔ)上對其功能學(xué)及與疾病的關(guān)系深入了解。從下文可知，同時(shí)發(fā)現(xiàn)的大量差異蛋白具有共同的生理或病理作用，因此可作為相關(guān)聯(lián)的一組蛋白群整體研究。由于肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病不是完全分隔開的幾個(gè)階段，本文根據(jù)研究對象所處的主要病理狀態(tài)進(jìn)行分類表述。

2.1 蛋白質(zhì)組學(xué)與肥胖 糖尿病的危險(xiǎn)因素主要有糖耐量受損、家族史和肥胖，其中肥胖是2型糖尿病的最重要誘因之一[2]。鑒于肥胖人群中糖尿病的高發(fā)病率及當(dāng)今肥胖的高流行，找到肥胖對糖尿病的誘發(fā)機(jī)制十分必要，其機(jī)制的明確將為肥胖型糖尿病的預(yù)防和控制提供新的思路。

Brockman等[3]經(jīng)MS鑒定出的14-3-3在肥胖早期小鼠脂肪組織表達(dá)上調(diào)，肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶Pinl在肥胖小鼠脂肪組織表達(dá)下調(diào)，這可能與其細(xì)胞增殖、分化和保護(hù)作用相關(guān)。噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZD)是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)的激動劑，已經(jīng)證明TZD可以恢復(fù)脂肪細(xì)胞相關(guān)功能障礙，如炎癥活動和胰島素抵抗。Chen等[4]用MALDI-TOF-MS分析有無TZD治療的肥胖大鼠的內(nèi)臟脂肪組織，通過液相色譜及MS證明，利用TZD治療12 d后，77種蛋白質(zhì)水平發(fā)生改變，包括炎性分子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、膠原蛋白和免疫因子等，這些蛋白質(zhì)可能具有改善脂肪細(xì)胞功能的作用，從而得出TZD治療可以提高胰島素敏感性的結(jié)論。Tvarijonaviciute等[5]利用2-DE對比格犬控制體質(zhì)量前后的血清蛋白組學(xué)進(jìn)行分析，繪制出肥胖組和消瘦組的蛋白圖譜，對比顯示有3個(gè)點(diǎn)存在差異，鑒定后得到視黃醇結(jié)合蛋白4、凝聚素的前體表達(dá)上調(diào)，抗胰蛋白酶1表達(dá)下調(diào)。凝聚素作為載脂蛋白對血脂的調(diào)節(jié)有重要影響，而視黃醇結(jié)合蛋白4作為新近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，其升高與胰島素抵抗、肥胖及多種心血管危險(xiǎn)因子密切相關(guān)。王俊等[6]利用游離膠分餾器(OFFGEL)電泳-差異蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對肥胖亞型、非肥胖亞型糖尿病患者組和對照組分別鑒定出391、415、371 種差異蛋白，結(jié)果表明脂聯(lián)素在肥胖亞型糖尿病患者血漿中低表達(dá)，基質(zhì)交感分子1 (stromal interaction molecule 1，STIM1) 在肥胖亞型糖尿病患者血漿中高表達(dá)。STIM1是鈣庫操控鈣通道(store-operated channels，SOC)的感受器，通過調(diào)控鈣庫，操控鈣內(nèi)流，補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。在糖尿病及肥胖患者體內(nèi)鈣離子水平表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)高鈣而體鈣缺乏，這可能與STIM1高表達(dá)有關(guān)；絲氨酸蛋白激酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶等6種蛋白激酶在非肥胖亞型糖尿病患者血漿中高表達(dá)。脂聯(lián)素、STIM1和一系列蛋白激酶在肥胖亞型、非肥胖亞型糖尿病的發(fā)病機(jī)制上可能存在差異。

Bae等[7]利用2-DE-差異蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在肥胖者的胰島素敏感組織如肝臟、骨骼肌和脂肪組織中存在大量的差異蛋白，其中白細(xì)胞共同相關(guān)抗原磷酸酶、蛋白酪氨酸磷酸酶α( protein tyrosine phosphatase α，PTP-α)、蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP-1B)均有高表達(dá)，后續(xù)研究證明這些酶參與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Kim等[8]利用2-DE分析肥胖人群血漿，并用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明在肥胖人群中血漿銅藍(lán)蛋白和纖維蛋白原水平明顯升高，且與肥胖程度呈正相關(guān)。Insenser等[9]選取了6例病態(tài)肥胖患者及6例正常人的皮下組織及內(nèi)臟脂肪組織，利用2-DE和MALDI-TOF-MS對其進(jìn)行分析，結(jié)果顯示羧酸酯酶-1、14-3-3等蛋白水平在肥胖患者中增高，補(bǔ)體C3、纖維蛋白原C鏈、清蛋白、α1-抗胰蛋白酶和過氧化物酶6等下降。Oliva等[10]對糖耐量正常的肥胖和正常孕婦剖宮產(chǎn)后的胎盤蛋白進(jìn)行研究，結(jié)果顯示肥胖患者的人膜聯(lián)蛋白A5、ATP合酶β亞基、腦酸溶性蛋白1(brainacidsolubleprotein 1，BASP1)、鐵蛋白輕鏈、波型蛋白降低，α-1-抗胰蛋白酶、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(glucose-regulated proteins 75，GRP75)升高。這些蛋白質(zhì)在調(diào)節(jié)生長、構(gòu)建細(xì)胞骨架、氧化應(yīng)激、炎癥、凝血和凋亡中發(fā)揮作用，其改變可能對胎兒的生長發(fā)育有重大影響。上述研究均利用非定向蛋白組學(xué)方法找出了正常人與肥胖患者間大量的新型差異蛋白，并推測這些蛋白可能與肥胖的發(fā)展有關(guān)。

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)與胰島素抵抗 胰島素抵抗指一定量的胰島素與其特異性受體結(jié)合后所產(chǎn)生的生物效應(yīng)低于正常。表現(xiàn)為外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對葡萄糖攝取減少及胰島素抑制肝葡萄糖輸出的作用減弱[11]。胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多基因及多階段的復(fù)雜過程，用蛋白質(zhì)組學(xué)策略從整體水平來探討胰島素抵抗的發(fā)生與發(fā)展規(guī)律，為研究者提供了預(yù)防和治療糖尿病的思路。

Lim等[12]為了增加準(zhǔn)確度，利用單向電泳和2-DE兩種方法找到差異蛋白，平行進(jìn)行MS，比較胰島素抵抗大鼠與正常大鼠脂肪細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，差異蛋白包括補(bǔ)體C6、金屬蛋白酶組織抑制物1、組織蛋白酶B、脂蛋白、硫氧還原蛋白、凝溶膠蛋白等，均參與了免疫反應(yīng)、細(xì)胞外組織重塑和氧化應(yīng)激。Kameji等[13]研究發(fā)現(xiàn)，存在氧化應(yīng)激和胰島素抵抗的小鼠脂肪細(xì)胞中，腫瘤壞死因子α水平升高；Yan等[14]發(fā)現(xiàn)茶中的兒茶素可以減少血清中的腫瘤壞死因子α水平，從而衰減活性氧的產(chǎn)生和緩解胰島素抵抗。

Giebelstein等[15]利用2-DE及高效液相色譜與MS聯(lián)用技術(shù)分析胰島素抵抗患者的骨骼肌，結(jié)果表明糖酵解酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷酸葡萄糖變位酶2、骨骼肌烯醇化酶和丙酮酸激酶等的水平明顯高于正常人，與上述糖酵解酶水平增加相反，線粒體蛋白烯酰基輔酶A異構(gòu)酶水平減少，表明糖酵解酶的增加和線粒體蛋白的減少可能導(dǎo)致胰島素抵抗和2型糖尿病。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)與2型糖尿病 糖尿病是由胰島素分泌異常和/或胰島素活性異常所導(dǎo)致的一種代謝疾病，此疾病會引起伴隨糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的高血糖癥狀[16]。作為引起疾病的主要標(biāo)志物或作為由疾病引起的繼發(fā)效應(yīng)，蛋白質(zhì)水平的變化對疾病的研究意義重大。

2.3.1 組織中的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 Mullen[17]應(yīng)用2-DE技術(shù)研究了正常大鼠與糖尿病GK大鼠腓腸肌線粒體中的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脫氫酶、細(xì)胞色素b-c1復(fù)合物、異檸檬酸脫氫酶等蛋白在內(nèi)的線粒體標(biāo)志蛋白在糖尿病模型GK大鼠中表達(dá)量均顯著降低。Han等[18]利用放射性核素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ) 技術(shù)在肥胖大鼠、肥胖糖尿病大鼠以及正常大鼠的胰島組織中進(jìn)行研究，在肥胖糖尿病大鼠與正常大鼠的比較中發(fā)現(xiàn)54個(gè)差異蛋白，在肥胖大鼠與正常大鼠之間發(fā)現(xiàn)58個(gè)差異蛋白，并且首次發(fā)現(xiàn)了一些與胰島素?fù)p傷、線粒體功能紊亂、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、微血管缺血相關(guān)的蛋白質(zhì)。Essop等[19]分離出18～20周雌性db/db鼠心臟組織中的線粒體研究發(fā)現(xiàn)ATP合酶D鏈、輔酶細(xì)胞色素C還原酶核心蛋白1和電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白亞基α水平增高，α平滑肌肌動蛋白、α心肌肌動蛋白、肌球蛋白重鏈α和肌球蛋白結(jié)合蛋白C水平下降，以上蛋白水平的改變可能與心臟收縮功能下降有關(guān)，從而引起糖尿病大血管病變等相關(guān)并發(fā)癥。Zhang等[20]利用2-DE和MS對患有2型糖尿病腎病的db/db鼠腎臟進(jìn)行研究，db/m鼠作為對照組。經(jīng)對比及鑒定發(fā)現(xiàn)，天冬氨酸酰酶3、環(huán)氧化物酶2、D-乳酸脫氫酶、蛋白激酶C抑制劑蛋白1、E鈣黏蛋白豐度下降，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)的第2合成酶(HMGCS2)、線粒體酰輔酶A合成酶2、醛縮酶B亞型2、波形蛋白、免疫球蛋白重鏈V類似物豐度上升，上述蛋白可能與增強(qiáng)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化有關(guān)，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化會導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞重塑為成纖維細(xì)胞，失去原有功能。HMGCS2是生酮作用中的關(guān)鍵酶，其增加表明2型糖尿病患者腎臟具有高于常人的生酮作用?？偟膩碚f，這些研究結(jié)果表明糖尿病腎臟具有多余的生酮活動，糖尿病腎病中增強(qiáng)的酮體生成作用可能為一種新的糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制。

Murri等[21]對單純肥胖者與2型糖尿病伴肥胖者的脂肪組織進(jìn)行對比研究，糖尿病患者谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶μ2、過氧化物酶、抗凝血酶Ⅲ、載脂蛋白A-Ⅳ、免疫球蛋白κ鏈C區(qū)、線粒體醛脫氫酶和肌動蛋白豐度增加，膜聯(lián)蛋白-A1、醛脫氫酶1、黏著斑蛋白豐度下降，這些蛋白參與了細(xì)胞骨架的功能和結(jié)構(gòu)、氧化應(yīng)激、炎癥和類視黃醇代謝，將來在2型糖尿病的發(fā)展以及功能障礙的研究中，這些蛋白質(zhì)可以發(fā)揮候選分子的作用。Hwang等[22]分析正常人、單純肥胖患者以及2型糖尿病患者的骨骼肌蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示92個(gè)蛋白點(diǎn)與胰島素抵抗有關(guān)，其中15個(gè)點(diǎn)具有明顯的豐度變化，如TCP-1亞基、蛋白水解酶復(fù)合體水平增加，結(jié)蛋白和α輔肌動蛋白2水平下降，結(jié)果證實(shí)在胰島素抵抗的肌肉中線粒體數(shù)量減少，蛋白質(zhì)降解，肌肉結(jié)構(gòu)改變。

2.3.2 血液中的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 Takahashi等[23]利用iTRAQ技術(shù)，對2型糖尿病KK-Ay鼠血清進(jìn)行研究，確定了8種蛋白存在變化，其中補(bǔ)體因子B、載脂蛋白A-Ⅱ、絲氨酸蛋白酶抑制劑A3K(Serpina3k)、血纖維蛋白溶酶原等水平明顯升高。在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人類視網(wǎng)膜微血管同源性Serpina3k能夠增加跨內(nèi)皮通透性，這可能與糖尿病和/或糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

Lu等[24]比較確診時(shí)間少于5年且合并視網(wǎng)膜病變的2型糖尿病患者與確診時(shí)間超過10年但未出現(xiàn)視網(wǎng)膜病變的2型糖尿病患者的血清蛋白質(zhì)組，確定了77個(gè)血漿差異蛋白，其代表28個(gè)獨(dú)特的基因產(chǎn)物，其中生育酚結(jié)合蛋白(afamin)、α1-抗胰蛋白酶、載脂蛋白E、結(jié)合珠蛋白等水平下降；抗凝血酶Ⅲ、纖維蛋白原α、激肽原1、鋅-α-2-糖蛋白等水平上升，這些蛋白質(zhì)主要參與炎性反應(yīng)和凝血作用。作者認(rèn)為利用該方法確定的幾個(gè)蛋白質(zhì)可以作為潛在的糖尿病性視網(wǎng)膜病的生物標(biāo)志物，與糖尿病的進(jìn)展有關(guān)。

2.3.3 其他體液中的蛋白質(zhì)組學(xué)研究 Zürbig等[25]運(yùn)用毛細(xì)管電泳-電荷耦合質(zhì)譜法分析了正常人、新發(fā)糖尿病及糖尿病腎病進(jìn)展期患者尿中的低分子量蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示膠原蛋白片段、免疫球蛋白受體聚合、CD99抗原、尿調(diào)節(jié)素(在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中產(chǎn)生，最后通過蛋白酶水解切割釋放到尿液中，能夠阻礙腎結(jié)石和尿路感染發(fā)生)等在糖尿病腎病進(jìn)展期患者的尿液中水平均下降，間接證明上述蛋白與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可以作為預(yù)測糖尿病腎病的生物標(biāo)志物，在早期階段通過非侵入性方法對糖尿病腎病進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。Riaz等[26]收集了100例性別相同、年齡相似、病情發(fā)展程度相當(dāng)?shù)?型糖尿病患者及正常對照組的尿樣，運(yùn)用二維分析液相色譜儀(一維色譜聚焦，二維反相色譜法)和MS發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者中轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、人α1微球蛋白/bikunin前體蛋白、結(jié)合珠蛋白前體水平減少；清蛋白、鋅-α-2-糖蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白4、人鈣黏附蛋白水平下降，上述蛋白的發(fā)現(xiàn)不僅在早期診斷，而且在評估2型糖尿病的預(yù)后方面都將有幫助。Paasch等[27]收集1型糖尿病患者、2型糖尿病患者、單純肥胖患者和健康人的精液，對其中的精子細(xì)胞運(yùn)用2-DE進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與健康人相比，其他3組共有79個(gè)蛋白點(diǎn)存在明顯變化。MS鑒定，1型糖尿病組有12種蛋白水平發(fā)生變化，2型糖尿病組有71種，單純肥胖組有13種。1型糖尿病組和2型糖尿病組精囊蛋白、簇集蛋白、乳鐵蛋白顯著增加；β-半乳糖苷酶-1樣蛋白是惟一的在3個(gè)病理情況下均被檢測到下降的蛋白質(zhì)，前3種蛋白質(zhì)是附睪蛋白酶(EPPIN)抑制劑復(fù)合物的組成部分。EPPIN被認(rèn)為具有完成受精相關(guān)的功能作用，如射精、精子的保護(hù)，運(yùn)動能力的調(diào)節(jié)和增強(qiáng)頂體反應(yīng)；β-半乳糖苷酶-1樣蛋白作為糖基水解酶蛋白質(zhì)，其功能與精子成熟有關(guān)。

3 現(xiàn)狀與展望

使用2-DE凝膠技術(shù)為基礎(chǔ)的方法對蛋白質(zhì)進(jìn)行研究已經(jīng)廣泛開展，其缺點(diǎn)為研究結(jié)果的重現(xiàn)性和敏感度有限。MS敏感度高，可靠性強(qiáng)，但是不適宜大量蛋白質(zhì)的快速鑒別[28]。此外，對于肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病系列的蛋白質(zhì)組學(xué)研究仍存在局限性，目前的研究幾乎都僅限于篩選差異蛋白質(zhì)，而功能研究還不是很深入，對各種差異蛋白相互作用的研究更少。

未來對肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病系列的蛋白質(zhì)組學(xué)研究主要在以下幾方面存在挑戰(zhàn)：(1)豐度極低的蛋白質(zhì)變化非常小，當(dāng)前的蛋白質(zhì)組學(xué)工具很難檢測到。但這些低豐度蛋白質(zhì)或小的變化，可能對維持細(xì)胞正常功能起到非常關(guān)鍵的作用，也可能是關(guān)鍵的功能調(diào)控機(jī)制。(2)信息快速調(diào)節(jié)蛋白的分泌和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控是一個(gè)動態(tài)過程，甚至是一過性的，及時(shí)地針對性蛋白動態(tài)捕捉技術(shù)仍有待研究。(3)多種蛋白質(zhì)作為一組蛋白的貢獻(xiàn)是相互關(guān)聯(lián)的，對其進(jìn)行系統(tǒng)研究能夠更好地理解作為一個(gè)功能整體對健康和疾病的影響。(4)就目前來看，研究的成本過于昂貴。

對于糖尿病，可以在細(xì)致分類的基礎(chǔ)上進(jìn)行有無差異蛋白-差異蛋白鑒定-蛋白功能、相互作用及影響-藥物靶向治療的縱向研究，揭示這些蛋白質(zhì)在2型糖尿病發(fā)病過程中扮演的角色，為了解2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制、鑒定疾病的分子標(biāo)志物、針對性治療提供新的途徑和思路。

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