與黃瓜霜霉病抗性相關基因連鎖的分子標記研究

孟攀奇，蔡麗靜，張桂華，杜勝利

（1.天津科潤黃瓜研究所，300192；2.河北承德市興隆縣農牧局）

與黃瓜霜霉病抗性相關基因連鎖的分子標記研究

孟攀奇1，蔡麗靜2，張桂華1，杜勝利1

（1.天津科潤黃瓜研究所，300192；2.河北承德市興隆縣農牧局）

以黃瓜抗霜霉病和感霜霉病親本組合（Q9×Q10）的F2分離群體為試材，采用BSA法篩選到了1個AFLP引物組合P11M70在抗病池和感病池間表現(xiàn)多態(tài)，抗病池和抗病親本均具有大小約304 bp的特異譜帶，感病池和感病親本均擴增出了大小約為301 bp的特異片段。經F2單株驗證及連鎖分析，該特異片段與霜霉病抗病相關基因相連鎖，連鎖距離為5.22 cM。對特異片段的測序結果顯示，兩片段的大小分別為304 bp和301 bp，且2個片段的差異僅為3個“A”堿基的插入或缺失以及1個“C-T”的堿基突變。將該AFLP標記成功地轉換為了簡單實用的SCAR標記。

黃瓜；霜霉?。豢剐韵嚓P基因；分子標記

黃瓜霜霉病是黃瓜三大主要病害之一，流行年份可導致黃瓜減產達30%～50%。應用抗病品種防治植物病害是最為經濟、安全、有效的途徑。以往抗病品種的選育主要采用常規(guī)育種技術，對材料抗病性的鑒定依靠田間鑒定方法，受環(huán)境因素影響較大，鑒定結果也不夠準確，即便是采用人工接種抗病鑒定技術，也由于其病原菌活體寄生的原因而受到季節(jié)限制。分子標記技術的飛速發(fā)展，為利用與目標基因緊密連鎖的分子標記進行性狀鑒定提供了一條新途徑。

目前關于黃瓜霜霉病的分子標記研究已有部分報道。丁國華等[1]找到了1個RAPD標記，與黃瓜霜霉病抗性基因之間的連鎖距離為7.85 cM。白智龍等[2]分春秋兩季進行了黃瓜霜霉病抗性QTL的檢測，共檢測到3個QTLs，其中貢獻率最大的1個QTL在春秋兩季的貢獻率分別達到了36.4%和27.3%。張素勤等[3]篩選到了1個與控制黃瓜霜霉病某個感病基因連鎖的AFLP標記，該標記解釋霜霉病抗性表型變異的11.34%。但上述文獻所報道的分子標記與黃瓜霜霉病抗性基因間的遺傳連鎖距離均較遠，用于黃瓜霜霉病抗性輔助育種尚有較大誤差。

本研究分別以高抗和高感黃瓜霜霉病的2個材料為親本，配制F2分離群體，采用苗期人工接種抗病性鑒定技術和田間抗病性直接鑒定方法，對F2分離后代的抗性進行了鑒定；同時，結合BSA法（分離群體混合分析法）采用AFLP技術，篩選與黃瓜抗霜霉病性狀基因相連鎖的分子標記，為利用分子技術進行黃瓜抗霜霉病輔助育種以及霜霉病抗性基因的克隆奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為高抗和高感黃瓜霜霉病的黃瓜高代自交系Q9、Q10及其F2分離后代。AFLP引物購自上海生工生物工程公司。

試驗于2002-2004年在天津科潤農業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所完成。

1.2 試驗方法

①抗性分離群體的構建及黃瓜霜霉病抗病性鑒定 將供試材料播種于塑料溫室中，常規(guī)管理。采用噴霧法于3片真葉期進行霜霉病苗期人工接種抗性鑒定。采用呂淑珍等[4]所述的分級標準，分別于接種后7、14、20 d左右調查霜霉病的發(fā)病情況。

②DNA的提取 選取高抗霜霉病和高感霜霉病的F2單株各5株，組成抗病池和感病池。分單株提取DNA和PCR擴增。DNA提取采用CTAB法[5]。

③AFLP分析 參照Vos等[6]的方法進行AFLP分析。采用MseI和PstI 2種內切酶進行基因組DNA的酶切；預擴增引物不含選擇性堿基。

③引物篩選及分子標記的驗證 對抗、感親本及抗、感池內各單株進行PCR擴增，將在抗感親本間及抗感兩池間同時產生差異譜帶的引物組合，作為與黃瓜霜霉病抗性相關基因連鎖的候補引物組合；然后利用F2單株對候補引物組合進行吻合性驗證。

⑤特異片段的測序 特異片段的回收純化參照張桂華[5]的方法。序列測定由大連寶生物公司進行。

⑥SCAR標記引物的設計與PCR擴增 根據(jù)測序結果以及引物設計的原則，用primer 3.0軟件設計特異性引物。SCAR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；然后72℃延伸7 min。

2 結果與分析

2.1 F2分離群體黃瓜霜霉病抗性的鑒定

根據(jù)分級標準將134個F2單株分為抗病、中間類型和感病3個級別，其中抗病單株27株，感病單株32株，中間類型75株，適合性測驗分析顯示，基本符合1∶2∶1的分離比例 （表1）。表明在本試驗所采用的供試材料的遺傳背景下，黃瓜對霜霉病的抗性是由單隱性基因控制的，且中間類型單株田間表現(xiàn)偏向于感病親本，感病相對抗病為顯性且為不完全顯性。

2.2 與黃瓜霜霉病抗病基因相連鎖的分子標記的篩選

篩選到76對在雙親間具有多態(tài)性的引物組合，其中共顯性AFLP標記（P11M70-304 bp/301 bp）在抗病池和感病池之間也具有相同的多態(tài)性?？共∮H本和抗病池單株都具有304 bp的特異片段，感病親本和感病池單株都有301 bp的特異片段（圖1）。

2.3 候補分子標記的驗證

用共顯性標記P11M70對其他F2單株進行了吻合率的驗證。在其余124個F2單株中，共有7株發(fā)生了交換。由此計算，所篩選到的標記與目標基因之間的遺傳距離為5.22 cM，圖2為引物組合P11M70在部分F2單株中的驗證。

2.4 分子標記測序

將目標片段回收純化后測序，測序結果顯示，2個片段的大小分別為304 bp和301 bp，該2個片段的差異僅表現(xiàn)在3個“A”堿基的插入或缺失以及1個“C-T”的堿基突變。

表1 黃瓜霜霉病田間鑒定結果

圖1 篩選到的共顯性AFLP標記P11M70-304 bp/301 bp

2.5 SCAR引物設計與擴增

根據(jù)測序結果及引物設計的一般原則，設計了1對特異性引物，譜帶理論大小為220 bp和217 bp。圖3結果顯示，抗病親本和抗病單株均具有220 bp的特異譜帶，感病親本和感病單株均具有217 bp的特異譜帶。將該AFLP標記成功地轉換為了簡單實用的SCAR標記。與該片段序列有關的內容已申報國家發(fā)明專利（專利號為：ZL200410018667.0）。

圖2 引物組合P11M70在部分F2單株中的驗證

圖3 SCAR引物對親本和部分F2單株的擴增結果

3 討論與結論

有關黃瓜對霜霉病抗性的遺傳規(guī)律，前人進行了大量觀察研究?？赡苁茄芯空咚捎玫牟牧系倪z傳背景不同，即抗性基因組成可能不同，加之沒有采用統(tǒng)一的抗性鑒定方法及分級標準，研究結果各不相同。大多研究結果認為，黃瓜對霜霉病的抗性是由多基因控制[4，7～9]，但也有單基因控制的報道[10]。本研究對抗霜霉病和感霜霉病親本材料及其F2分離群體進行了田間抗病性鑒定和AFLP分子標記研究。田間鑒定結果表明，F(xiàn)2分離群體中抗病、中間類型和感病單株的比例約為1∶2∶1，且中間類型單株的抗病性偏向感病親本，說明在本研究采用的試材的遺傳背景下，黃瓜對霜霉病的抗性是由單隱性基因控制的，感病性相對于抗病性為不完全顯性。

BSA分析方法是Michelmore等[11]于1991年建立的一種連鎖標記分析方法。該方法適合由單基因控制的質量性狀。但筆者在研究中發(fā)現(xiàn)，若為完全顯性，很易建立抗感池，若為不完全顯性，在F2后代性狀鑒定分級時很容易發(fā)生劃分錯誤，即便是一個單株的鑒定失誤也會導致分池不準確。本研究中黃瓜對霜霉病的抗性就屬不完全顯性，所以參照張桂華等[12]的方法組建抗病池和感病池進行標記篩選，篩選到了與控制黃瓜霜霉病抗性基因緊密連鎖的AFLP標記，并轉換為了簡單實用的SCAR標記。

[1]丁國華，秦智偉，周秀艷，等.黃瓜霜霉病抗病基因的RAPD及SCAR標記[J].西北植物學報，2007，27（9）：1 747-1 751.

[2]白智龍，袁曉君，蔡潤，等.黃瓜霜霉病抗性QTL分析[J].自然科學進展，2008，18（6）：706-710.

[3]張素勤，顧興芳，張圣平，等.黃瓜霜霉病抗性相關基因的AFLP標記[J].西北植物學報，2010，30（7）：1 320-1 324.

[4]呂淑珍，張本群，李淑菊.黃瓜霜霉病抗病遺傳及抗性鑒定方法研究進展[C]//中國主要蔬菜抗病育種進展.北京：科學出版社，1995：392-394.

[5]張桂華.黃瓜白粉病抗性相關基因的分子標記研究[D].陜西楊凌：西北農林科技大學，2003：23-28.

[6]Vos P,Hongers R,Bleeker M,et al.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acids Res,1995,23(21): 4 407-4 414.

[7]馮東昕，李寶棟.主要瓜類作物抗霜霉病育種研究進展[J].中國蔬菜，1997（2）：45-48.

[8]侯鋒.黃瓜[M].天津：天津科學技術出版社，1999.

[9]Jenkins J M.Studies on the inheritance of downy mildew resistance and of other characters in cucumbers[J].J Hered, 1946,37:267-276.

[10]Van Vliet G J A,Meysing W D.Inheritance of resistance toPsuedoperonospore cubensisRost.in cucumber(Cucumis sativusL.)[J].Euphytica,1974,23:251-255.

[11]Michelmore R W,Paranand I,Kessali R V.Identification of markers linked to disease resistance gene by bulked segregant analysis:a rapid method to detect markers in specific genomic regions using segregating populations[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:9 829-9 832.

[12]張桂華，杜勝利，王鳴，等.與黃瓜抗白粉病基因連鎖的AFLP標記的獲得[J].園藝學報，2004，31（2）：189-192.

Study on Molecular Markers Linked to Cucumber Downy Mildew Resistance Gene

MENG Panqi1,CAI Lijing2,ZHANG Guihua1,DU Shengli1
(1.Tianjin Kernel Cucumber Research Institute,300192; 2.Xinglong County Agriculture and Animal Husbandry Bureau of Chengde City)

With an F2population between a highly resistant parent Q9 and a highly susceptible parent Q10 as materials, we screened out an AFLP marker P11M70,which showed polymorphism between resistant pool and susceptible pool of cucumber downy mildew disease by using BSA method.The resistant parent and resistant F2plants possessed the 304 bp fragment,and the 301 bp fragment for the susceptible parent and susceptible F2plants.The results of linkage analysis showed that,the AFLP marker was tightly linked to the cucumber downy mildew resistance related gene,and the genetic distance was 5.22 cM.And the results of fragment sequencing showed that,their length were 304 bp and 301 bp respectively,and the difference of the two fragments lied in the insert-deletion(indel)of three A base and a mutation of C to T base.The AFLP marker was successfully converted into SCAR marker.

Cucumber;Downy mildew;Resistance-related gene;Molecular marker

S642.2

A

1001-3547（2014）08-0012-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2014.08.004

天津市重大科技專項（工程）項目（12ZCDZNC03500，12ZCDZNC03700）

孟攀奇（1973-），女，碩士，副研究員，主要從事黃瓜品種的推廣、研究工作

2014-01-16