細胞直接重編程
——治療糖尿病的新技術(shù)*

任麗偉， 楊曉菲， 李富榮

(暨南大學第二臨床醫(yī)學院，深圳市人民醫(yī)院干細胞與細胞治療重點實驗室，廣東 深圳 518020)

·綜 述·

細胞直接重編程
——治療糖尿病的新技術(shù)*

任麗偉， 楊曉菲， 李富榮△

(暨南大學第二臨床醫(yī)學院，深圳市人民醫(yī)院干細胞與細胞治療重點實驗室，廣東 深圳 518020)

糖尿病是一類伴有不同程度胰島素分泌缺乏或胰島功能障礙的代謝性疾病。已成為繼心血管病和腫瘤之后嚴重危害人類健康的第三大慢性疾病和全球第五大致死疾病。其目前的治療方法主要是長期服用藥物和注射胰島素，沒有根治手段。糖尿病患者的血管、神經(jīng)等長期受血糖水平波動變化的影響產(chǎn)生一系列的病理變化，其中發(fā)病率最高的并發(fā)癥為白內(nèi)障、神經(jīng)系統(tǒng)病變和背景性視網(wǎng)膜病變，給眾多患者的生活、工作帶來極大的困擾，所以尋找治愈糖尿病的新方法成為一件亟待解決的難題。胰島細胞替代治療和再生治療或?qū)⒊蔀槲磥碇斡悄虿〉挠行緩街籟1]，但由于胰島供體缺乏，免疫排斥反應,以及各種干細胞[2-3]向胰島β細胞的轉(zhuǎn)分化效率低、成熟度差和致瘤風險等問題無法在臨床推廣和應用。近來，新發(fā)展的細胞直接重編程(cell direct reprogramming)技術(shù)，可將一種終末分化細胞直接轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N終末分化的細胞，不需要經(jīng)過將成體細胞重編程為胚胎樣干細胞、再由胚胎樣干細胞分化為另一種終末分化細胞，避免了操作的復雜性，細胞免疫排斥反應以及倫理學和法律問題等?？梢詫Ⅲw內(nèi)富裕細胞直接重編程為胰島β細胞，為糖尿病患者提供缺失的胰島β細胞[4]。它有可能成為治療或治愈糖尿病的新方法。下面將圍繞體細胞直接重編程為胰島β細胞研究進展做一綜述。

1 細胞直接重編程技術(shù)與原理

細胞直接重編程是將一種已分化的細胞不經(jīng)過去分化與再分化過程直接轉(zhuǎn)分化為另一種細胞。重編程包括兩個方面的內(nèi)容：一是轉(zhuǎn)決定——是多/雙潛能細胞向目的細胞的分化，這種細胞在正常生理條件下不具有分化為目的細胞的能力[5]；二是轉(zhuǎn)分化(即直接重編程)——一種終末分化的體細胞向另外一種終末分化體細胞的轉(zhuǎn)化。重編程應用各種手段影響基因的表達，實現(xiàn)細胞類型的轉(zhuǎn)變，使細胞表現(xiàn)出目的細胞的功能[6]。

已分化的體細胞含有生物個體生長發(fā)育的全部基因，而組織細胞生長分化的過程即是不同基因的選擇性表達過程。細胞直接重編程也是一個基因選擇性表達的過程，在直接重編程中最關(guān)鍵的誘導因素是轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)是一群能與基因5’端上游特定序列專一性結(jié)合，從而保證目的基因在正確位置表達蛋白質(zhì)分子。特定的轉(zhuǎn)錄因子與沉默的特定基因結(jié)合，干擾原有的基因表達譜表達目的基因，即完成了重編程過程。此過程獲得了特殊功能的細胞，就可以對相關(guān)細胞損傷和功能缺失類疾病進行補充。細胞直接重編程作為再生醫(yī)學的分支，可通過對體內(nèi)細胞直接重編程應用于臨床疾病治療[7]。

2 體細胞直接重編程為胰島β細胞

2.1 胰腺其它細胞直接重編程為胰島β細胞 胰腺中β細胞外的其它細胞應該是與β細胞同源性最接近的群體，它們之間具有更多相同的表觀遺傳特點[2]，并且與β細胞有著相似的周圍環(huán)境，利于重編的β細胞功能的激發(fā)。胰十二指腸同源盒1(pancreatic and duodenal homeobox factor 1, Pdx1)作為胰腺分化的第一個轉(zhuǎn)錄因子，在β細胞中高表達，在胰腺外分泌細胞中低表達，卻未在α細胞中表達[8]。Zhou等[9]利用腺病毒在胰腺細胞中優(yōu)先感染外分泌細胞，而不是α細胞等內(nèi)分泌細胞這一現(xiàn)象，將裝有轉(zhuǎn)錄因子的腺病毒直接注入小鼠胰腺，獲得外分泌細胞向β細胞直接重編程的最佳轉(zhuǎn)錄因子組合——Pdx1+ 神經(jīng)元素3(neurogenin 3, Ngn3)+肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A(v-maf musculoaponeurotic fibrosareoma oncogene homologue A, MafA)。形成的胰島素分泌細胞散落在外分泌細胞間，其形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和基因表達均與正常β細胞相似。重編的胰島素分泌細胞周圍有新血管形成，如此一來，分泌的胰島素就可迅速進入血液循環(huán)并運送至全身而發(fā)揮作用，降低血糖水平。但是幾乎所有被標記的重編β細胞兼具備外分泌細胞的特征。2012年，Akinci等[10]選擇AR42j-B13 的外分泌細胞系為對象做體外實驗，同樣利用轉(zhuǎn)錄因子Pdx1、 Ngn3和MafA的組合同時轉(zhuǎn)染，之后外分泌細胞系特性消失，細胞停止分裂并出現(xiàn)形態(tài)扁平的變化。直接重編程后的細胞基因表達也發(fā)生改變，外分泌細胞有關(guān)的基因表達受到抑制，而內(nèi)分泌的胰島素基因表達上調(diào)。分泌的胰島素可逆轉(zhuǎn)高血糖水平，但其分泌不具葡萄糖刺激性。但是，若細胞以恒定速率分泌胰島素，機體將存在高糖不降或低血糖的風險。另外，直接重編程的胰島素分泌細胞成熟度很低，胰島β細胞的其它重要基因，如葡萄糖轉(zhuǎn)運載體-2(glucose transporter-2, Glut2)和形成 ATP敏感性鉀通道-KATP通道中心通透孔的亞基-kir6.2未能表達，并且其在體內(nèi)誘導的胰島素分泌細胞的形態(tài)似外分泌細胞。之后，Lima等[11]分離人體胰島外分泌細胞并在體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其迅速去分化為單層間質(zhì)細胞，將Pdx1、Ngn3、MafA和配對盒基因4(paired box gene，Pax4)等4種轉(zhuǎn)錄因子導入該細胞，獲得了分泌胰高血糖素的α樣細胞。為獲得β樣細胞，他們將分離的人體外分泌細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并向其中加入上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制劑——Rho相關(guān)類激酶和轉(zhuǎn)化生長因子-β1抑制劑，最終獲得了葡萄糖敏感的胰島素分泌細胞。該細胞經(jīng)腎包膜下移植入非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency disease, NOD/SCID)小鼠后緩解了血糖水平，有一定的治療效果。 Lee等[12]特異性地將人體胰島外分泌細胞中的導管細胞分離出來，證明其可直接重編程為β樣細胞，并找到了比Pdx1+Ngn3+MafA更高效率的轉(zhuǎn)錄因子組合——Pdx1、Ngn3、MafA和配對盒6(paired box gene 6，Pax6)。

Al-Hasani等[13]構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠使Pax4在胰島α細胞中表達，獲得了過度增生的胰島β細胞團，并且胰島內(nèi)的其它內(nèi)分泌細胞(α細胞、D細胞等)數(shù)量均有一定程度的增加。在胰腺的正常胚胎發(fā)育過程中，胰腺內(nèi)分泌細胞的分化不是同時發(fā)生的，α細胞的分化要先于β細胞[14-15]。他們發(fā)現(xiàn)Pax4在α細胞中的錯誤表達，使其轉(zhuǎn)變?yōu)棣录毎?，并且激活了整個胰腺內(nèi)分泌細胞的再生，并對β細胞的再生過程作了詳細的研究。Pax4在α細胞中的異位表達動員導管內(nèi)皮前體細胞重新表達Ngn3，Ngn3調(diào)節(jié)小鼠的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導管內(nèi)皮細胞隨之增殖分化為α細胞，α細胞之后轉(zhuǎn)化為β細胞。這一過程與胚胎胰腺的發(fā)育一致。并且此增殖過程可被多次誘導。Xiao等[16]激活胰腺導管細胞中Ngn3的表達，卻沒有出現(xiàn)導管細胞向β細胞的轉(zhuǎn)化。

調(diào)節(jié)人體血糖的胰島內(nèi)分泌細胞不僅包括β細胞，α和δ細胞也在糖代謝的過程中起重要作用。若是糖尿病的治療只考慮到降糖激素而忽略了升糖激素，其結(jié)果得不償失。Li等[17]應用以胰腺腺泡細胞為靶細胞的腺病毒，將Pdx1、Ngn3和MafA三個轉(zhuǎn)錄因子按照不同組合轉(zhuǎn)染腺泡細胞。Pdx1+Ngn3+MafA組獲得了經(jīng)腺泡細胞轉(zhuǎn)化而來的β樣細胞，Ngn3+MafA組獲得了α樣和δ樣特殊分化的2種細胞，而單獨的轉(zhuǎn)錄因子Ngn3將腺泡細胞轉(zhuǎn)化為δ樣細胞。這就強調(diào)了Ngn3在建立胰島內(nèi)分泌狀態(tài)及其獨自提高δ細胞特殊分化的的重要作用。所以在進行重編程的過程中應著重強調(diào)各個轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的時間及順序，以獲得在正常胰島環(huán)境中的β細胞，穩(wěn)定血糖。

Akinci等[10]還對直接重編程細胞的染色質(zhì)進行研究，證明Pdx1、 前胰島素原1(preproinsulin 1, Ins1)和Ins2基因啟動子組蛋白尾部的修飾與基因活性具有直接關(guān)系，直接重編后的細胞Ins1啟動子的DNA CpG島的甲基化減少。Bramswig等[18]也發(fā)現(xiàn)胰島α細胞和β細胞在組蛋白修飾上的差別——絕大部分α細胞中組蛋白H3第4位賴氨酸的三甲基化修飾(histone H3 lysine 4 trimethylation, H3K4me3) 和組蛋白H3第27位賴氨酸上三甲基化(histone H3 lysine 27 trimethylation, H3K27me3) 同時存在，而β細胞一般只有其中一種形式，即H3K4me3 或H3K27me3。H3K4me3通常與基因的激活有關(guān)，H3K27me3則與轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)。這2個標記出現(xiàn)在同一個基因上時被稱為二價標記，它多出現(xiàn)在多潛能、未分化的細胞。那么就表明α細胞的分化程度比β細胞低。這與在胚胎的發(fā)育過程中，α細胞的分化先于β細胞是一致的[14]。Pdx1的表達在α細胞中存在H3K27me3的這一抑制信號，將H3K27me3抑制則Pdx1得到激活,通過表觀遺傳的可塑性應用組蛋白甲基化抑制劑將α細胞直接重編為β樣細胞。

另外，甲狀腺激素可與核內(nèi)受體結(jié)合以調(diào)控依賴配基的轉(zhuǎn)錄因子，進而增強或減弱基因的表達，甲狀腺激素受體α(thyroid hormone receptor α,TRα)對β細胞團的增殖起著重要作用，可以讓胰島恢復功能[19]。實驗使用L-3,5,3-三碘甲狀腺氨酸處理腺泡細胞，增強TRα與磷酸肌醇3激酶的亞基——P85α的聯(lián)合，促進蛋白激酶B的活化，激活Pdx1、Ngn3、MafA在腺泡細胞的表達，而降低外分泌細胞基因表達，上調(diào)內(nèi)分泌細胞基因表達。這在一定程度上說明了機體內(nèi)的代謝物質(zhì)或器官是相互作用的，對于糖尿病的臨床治療具有指導作用。

2.2 肝細胞直接重編程為胰島β細胞 肝臟和胰腺同來源于腹側(cè)內(nèi)胚層的雙潛能細胞，肝細胞和胰腺細胞之間可以相互轉(zhuǎn)化，并且認為胰腺組織中有類似肝卵圓細胞存在，而這種細胞可以通過移植而轉(zhuǎn)分化為功能性肝細胞[4]。肝臟和胰腺在功能上也是相互聯(lián)系，尤其是在糖代謝方面[8]。那么肝臟與胰腺的同源性和肝臟細胞向胰島β細胞的轉(zhuǎn)化就有據(jù)可依。在體外實現(xiàn)肝細胞向胰島β細胞的直接重編程不僅需要特定的轉(zhuǎn)錄因子，而且對細胞培養(yǎng)的微環(huán)境有特殊要求。最適的微環(huán)境和合適的轉(zhuǎn)錄因子都是直接重編程成功的關(guān)鍵。在轉(zhuǎn)錄因子水平，是Pdx1啟動了胰腺在早期前腸階段的分化，將胰腺與十二指腸、肝臟和膽管分開[20]。Cao等[21]將大鼠的肝細胞系細胞中轉(zhuǎn)染Pdx1-VP16獲得胰腺內(nèi)分泌祖細胞，經(jīng)實驗對比發(fā)現(xiàn)了在體外獲取具有功能的胰島素分泌細胞的一個必要微環(huán)境——高糖培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)錄因子Pax4具有促進Pdx1表達上調(diào)的作用，并提高轉(zhuǎn)分化細胞的葡萄糖刺激性[22]，促胰島素分泌肽-4與胰高血糖素樣肽1有53%的同源性，亦可強化Pdx1的作用[23]。高糖培養(yǎng)基作為向β細胞轉(zhuǎn)化的促進因子，恰好模擬了2型糖尿病發(fā)生發(fā)展中由于胰島素抵抗引起的胰島素分泌增多的代償過程。

對于肝臟細胞進一步直接重編程為胰島β細胞而非胰腺外分泌細胞，Yechoor等[24]發(fā)現(xiàn)只用Ngn3就足以將肝臟前體細胞直接重編程功能完整的β細胞：(1)可逆轉(zhuǎn)高血糖; (2)葡萄糖刺激性的胰島素分泌;(3)具有β細胞的特異性轉(zhuǎn)錄;(4)具有胰島的特異性轉(zhuǎn)錄級聯(lián);(5)分泌胰島的4種激素；(6)不能將肝細胞完全直接重編程為成熟的胰島β細胞。在體內(nèi)肝臟的卵原細胞也僅僅在Ngn3單獨的轉(zhuǎn)錄因子作用下獲得了功能較為完整β細胞，并可長時間逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠的血糖[25]。Limbert等[26]對骨髓間充質(zhì)干細胞的實驗也說明單獨依靠Ngn3就足以啟動與β細胞系有關(guān)的最主要的基因如Pdx1的表達。

Hickey等[27]將分化程度高且相對豐富的膽囊細胞進行直接重編程，應用Pdx1、MafA和Ngn3三者組合的轉(zhuǎn)錄因子進行轉(zhuǎn)染。細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染2 d后即表達胰島素和其它與β細胞相關(guān)的基因和蛋白。但是結(jié)果不理想，直接重編程的細胞不成熟。其多種內(nèi)分泌激素的分泌，不受葡萄糖的刺激。將其移植入糖尿病小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)移植部位有胰島素分泌細胞，但沒有降糖作用。RNA測序結(jié)果顯示誘導后的細胞跟正常胰島細胞相比，上千個基因表達存在差異，但膽囊的上皮細胞相對成纖維細胞更容易直接重編程成胰島β細胞。

Banga等[28]用另一種Pdx1、Ngn3和MafA的轉(zhuǎn)錄因子組合，通過小鼠的尾靜脈注入體內(nèi)，僅在肝臟出現(xiàn)胰島素分泌細胞。重編的胰島素分泌細胞形態(tài)為離散的導管細胞，經(jīng)分離檢測后發(fā)現(xiàn)其均為Y染色體性別決定區(qū)域相關(guān)的高速泳動族框因子9 [SRY (sex determining region Y) box 9，SOX9]陽性細胞。而SOX9+細胞起源于導管細胞發(fā)展的平臺期,是導管時期的早期細胞，并且自出生以后只在小導管中表達，在大導管中無表達。直接重編程的胰島β細胞有一定的成熟度(β細胞相應的標志——胰島素分泌顆粒、C-肽、葡萄糖刺激的胰島素分泌等)，并與周圍的小血管聯(lián)系將分泌的胰島素注入血流，但胰島素的分泌量不足以使血糖恢復正常水平，還具有其它細胞的特征[導管樣形態(tài)、細胞角蛋白19(cytokeratin,CK19)陽性、上皮性鈣黏附蛋白(epithelium cadherin，E-cadherin)陽性、分泌胰高血糖素等]。由于不同的轉(zhuǎn)錄因子作用在細胞分化的不同時段，Berneman-Zeitouni等[29]按照Pdx1、Pax4、MafA的順序，3種轉(zhuǎn)錄因子隔天轉(zhuǎn)染1個，獲得了比同時轉(zhuǎn)染更高的直接重編程效率。另外，NK6 同源框1作為成熟β細胞中表達的轉(zhuǎn)錄因子，可以激活Ngn3和Isl-1等β細胞的標志，還可以促進Pdx1直接重編程肝細胞為β細胞的成熟，或許對直接重編程β細胞的成熟具有關(guān)鍵作用[30]。

但是，肝臟本身也是機體攝取、儲存、合成和代謝葡萄糖的主要場所，在機體糖代謝中起著重要的作用，若是肝臟損傷亦會影響糖代謝或是導致肝性糖尿病。所以在體內(nèi)對肝臟直接重編程β細胞實驗，結(jié)果顯示對肝臟沒有明顯損傷[28]，但仍需考慮對肝臟細胞是否存在損傷。

2.3 其它細胞直接重編程為β細胞 肝膽細胞和胰腺細胞都在胚胎發(fā)育的過程來源于內(nèi)胚層，它們之間的重編程屬于同一胚層之間的轉(zhuǎn)化。那么，是否存在跨胚層重編程的可能性呢？

Mauda-Havakuk等[31]完成了這種設(shè)想，將屬外胚層細胞的角質(zhì)細胞直接重編程為β細胞。Pdx1作為向β細胞方向轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)染角質(zhì)細胞，獲得了胰島素分泌細胞，轉(zhuǎn)化效率為12.6%左右。直接重編程的細胞不僅分泌胰島素還分泌胰島其它內(nèi)分泌激素——胰高血糖素、生長抑素，未有外分泌基因(淀粉酶)、肝臟基因——乙醇脫氫酶1b(alcohol dehydrogenase 1 b， ADH1b)和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)的表達。 Pdx1將角質(zhì)細胞向胰島素分泌細胞的重編程還誘導出了內(nèi)胚層的標志基因SOX17和GATA結(jié)合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA4)的表達。

由于β細胞胰島素基因的組蛋白都是高度乙?；⑶冶纫葝u中的其它細胞基因的甲基化程度低。Katz等[32]聯(lián)合Pdx1和羅咪酯肽(組蛋白脫乙酰酶抑制劑)、5-氮雜胞苷(不能被甲基化的胞嘧啶核苷類似物)，將人皮膚纖維母細胞重編為胰島素、胰高血糖素分泌細胞。該細胞胰島素的分泌受葡萄糖的刺激，移植到糖尿病小鼠體內(nèi)可降低其血糖。

3 展望

細胞直接重編程作為再生醫(yī)學的新興分支，用于細胞治療糖尿病等細胞不可逆性損傷疾病，展現(xiàn)出其獨特的優(yōu)勢。直接重編程的細胞來源豐富，不僅可在同胚層的體細胞間進行轉(zhuǎn)化，還可以進行跨胚層轉(zhuǎn)化;另外，直接重編程的過程省卻了干細胞的環(huán)節(jié)，既規(guī)避了醫(yī)學倫理問題，又縮短去分化及再分化的復雜操作步驟與時間，還降低這一過程中畸胎瘤的發(fā)生；此外，若用于治療的重編細胞來源于自身細胞，就可避免免疫排斥反應，不用再像器官移植患者一樣長期服用免疫抑制劑。不同類型的糖尿病都是胰島素分泌不足(相對缺乏或者是絕對缺乏)所致，所以若是在體內(nèi)經(jīng)直接重編程技術(shù)形成具有生理性胰分泌模式的胰島素分泌細胞，其胰島素的分泌受到體內(nèi)環(huán)境的反饋調(diào)節(jié)，穩(wěn)定血糖在正常水平，那么，將可能治愈糖尿病。從此，糖尿病患者擺脫對胰島素注射的依賴和血糖大幅波動產(chǎn)生的各種并發(fā)癥，直接重編成技術(shù)可成為糖尿病治療的最有效手段。但是，目前重編仍有許多問題需要解決。首先，體細胞向β細胞的轉(zhuǎn)化效率較低，約20%左右；其次，重編程的β細胞的成熟度低，其表達多種細胞的標志基因，表達譜會介于重編細胞和β細胞之間。解決以上2個問題，必須從以下方面著手：選擇合適的體細胞來源，篩選合適的轉(zhuǎn)錄因子及組合，加強表觀遺傳的修飾和探索最適的重編程環(huán)境；另外，在直接重編程獲得β細胞同時，還需考慮血糖調(diào)控的α細胞，防止低血糖的發(fā)生。重編的β細胞在1型糖尿病患者是否仍舊會受到自身免疫損傷破壞也需要證明[33]，以防止重編治療失敗。細胞直接重編程作為剛剛起步的新學科，有很多問題需要解決，但是，直接重編程給糖尿病等正常細胞缺乏、損傷性疾病的治療帶來曙光，成為新型的疾病治療策略。

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Cell direct reprogramming: a new technique for treating diabetes

REN Li-wei, YANG Xiao-fei, LI Fu-Rong

(TheKeyLaboratoryofStemCellandCellularTherapy,TheSecondClinicalMedicalCollege,ShenzhenPeople’sHospital,JinanUniversity,Shenzhen518020,China.E-mail:frli62@163.com)

Diabetes is characterized by an absolute or relative deficiency in β-cell mass, which cannot be reversed with existing therapeutic strategies. The restoration of the endogenous islet β-cells can stabilize the level of blood glucose. The islet β-cells can be obtained from the directional differentiation of stem cells, but the process is complex and has the risk of teratomas generation. Cell direct reprogramming, one terminal differentiated cell can transdifferentiate into another kind of terminal differentiated cell, which is other than directional differentiation from stem cells. Direct reprogramming gives rise to the generation of islet β-cells from one terminal differentiated cell, may be preferable for diabetes therapy because of its unique advantage.

細胞直接重編程； 糖尿??； 胰島β細胞

Cell direct reprogramming; Diabetes; Islet β-cells

1000- 4718(2014)12- 2284- 05

2014- 05- 07

2014- 07- 25

國家自然科學基金資助項目(No.81270857); 深圳市基礎(chǔ)研究項目(No.JCYJ20120618153743791)

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.031

△通訊作者 Tel： 0755-25533000-2450； E-mail： frli62@163.com