應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)比較豬藍(lán)耳病ELISA抗體檢測(cè)試劑盒

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（安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽合肥 236001）

應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)比較豬藍(lán)耳病ELISA抗體檢測(cè)試劑盒

劉 華，詹松鶴，何長(zhǎng)生，朱良強(qiáng)

（安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，安徽合肥 236001）

[目的] 比較兩個(gè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ ELISA）檢測(cè)試劑盒結(jié)果的一致性。[方法] 對(duì)390份豬血清進(jìn)行PRRSV抗體ELISA檢測(cè)，應(yīng)用Kappa檢驗(yàn)比較兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果的一致性并進(jìn)行分析。[結(jié)果] 兩種試劑盒聯(lián)合檢測(cè)出250份PRRSV抗體陽(yáng)性和70份陰性，陽(yáng)性一致性為80.65%，陰性一致性為87.50%，符合率82.1%，結(jié)果一致性為中度一致（ Kappa 值=0.552） 。[結(jié)論]2種方法檢測(cè)結(jié)果一致性較好，建議根據(jù)實(shí)際需要選擇PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒。

豬繁殖與呼吸綜合征；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒；比較；Kappa檢驗(yàn)

豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起豬的一種接觸性傳染病。近年來(lái)，由于PRRS病毒基因變異，出現(xiàn)高致病性的病毒缺失變異毒株。已證實(shí)，它是引起我國(guó)南方地區(qū)“高熱病”的主要病原之一。高致病性藍(lán)耳病給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了很大經(jīng)濟(jì)損失。從2009年起，農(nóng)業(yè)部將其納入強(qiáng)制免疫監(jiān)測(cè)的動(dòng)物疫病范疇。PRRSV抗體監(jiān)測(cè)的方法較多，其中酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）為國(guó)際貿(mào)易中PRRSV抗體檢測(cè)指定方法之一，能迅速檢測(cè)大量樣品，而且該方法具有敏感、特異、簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。筆者用國(guó)內(nèi)較廣泛使用的兩種進(jìn)口豬藍(lán)耳病病毒抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)了豬血清，并對(duì)兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果的一致性進(jìn)行了分析，結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 豬血清

390份豬血清，為本實(shí)驗(yàn)室保存的春季集中檢測(cè)樣品。

1.2 檢測(cè)試劑

豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒，分別為2個(gè)廠家生產(chǎn)，產(chǎn)品A（批號(hào)：09418-CE820）；產(chǎn)品B（批號(hào)：8D6B）。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 產(chǎn)品A

為N-ELISA，即測(cè)定病毒N蛋白。方法如下：血清用樣品稀釋液進(jìn)行40倍稀釋，濃縮洗液恢復(fù)到室溫后混勻并用去離子水做10倍稀釋。在試劑盒中96孔板的C1、C2、 D1、D 2中加入100μL未稀釋的陰性對(duì)照，在A1、B1、A2、B2孔中加入100μL未稀釋的陽(yáng)性對(duì)照，被檢樣品各加兩孔，每孔100μL 。室溫孵育30 min，甩去液體，每孔用洗液300μL清洗3～5 次。每孔加入100μL酶標(biāo)抗體，室溫孵育30min。甩去液體，每孔用洗液300μL清洗3～5次。每孔加入100μL T MB底物溶液，室溫孵育15 min。加入100μL終止液并讀取OD650值。按試劑盒給定計(jì)算公式進(jìn)行判定，S/P值≥0.4判為陽(yáng)性。

1.3.2 產(chǎn)品B

為G-ELISA，即測(cè)定病毒G蛋白。方法如下：濃縮洗液恢復(fù)到室溫后混勻并用去離子水做10倍稀釋。濃縮的樣品稀釋液進(jìn)行3倍稀釋后，每孔加95μL至樣品稀釋板，加5μL待檢血清，混合后室溫靜置5min。在96孔包被板A1、B1孔內(nèi)加入50μL陰性對(duì)照，C1、D1孔中加入50μL陽(yáng)性對(duì)照。將預(yù)稀釋后的被檢樣品加入每孔，再加入45μL1×樣品稀釋液，37±2℃孵育1h，甩去液體，每孔用洗液300μL清洗3 次。每孔加入50μL酶標(biāo)抗體，37±2℃孵育1h。甩去液體，每孔用洗液300μL清洗3次。每孔加入50μL底物溶液，室溫暗室孵育10 min。加入50μL終止液混勻并讀取OD450值。按試劑盒給定計(jì)算公式進(jìn)行判定，IRPC值＞20判為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)2 種產(chǎn)品檢測(cè)的陽(yáng)性率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)；結(jié)果一致性進(jìn)行Kappa 檢驗(yàn)。Kappa系數(shù)<0，極差；0～ 0.2，微弱；0.21～0.4，弱；0.41～0.6，中度；0.61～0.8，高度；0.81～1.0，極強(qiáng)[1]。

2 結(jié)果與分析

產(chǎn)品A和B同時(shí)檢測(cè)390份血清樣本的結(jié)果比較見表1。

兩種試劑盒聯(lián)合檢出250份陽(yáng)性，陽(yáng)性率64.10%。產(chǎn)品A單獨(dú)檢出260份陽(yáng)性，陽(yáng)性率66.67%。產(chǎn)品B單獨(dú)檢出310份陽(yáng)性，陽(yáng)性率79.49%，略高于產(chǎn)品A（χ2=16.29，p<0.01）。兩個(gè)產(chǎn)品的陽(yáng)性結(jié)果一致性為80.6%；陰性結(jié)果一致性為87.5%；總體樣本結(jié)果的一致性為82.1%。根據(jù)Kappa一致性檢驗(yàn)，Kappa值為0.553（95%置信區(qū)間：0.459-0.647），表明兩種產(chǎn)品的一致性為中度一致。

3 討論

3.1 Kappa一致性檢驗(yàn)的應(yīng)用

在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究工作中，常遇到評(píng)估兩種檢測(cè)方法、兩名檢驗(yàn)人員或兩種設(shè)備檢測(cè)結(jié)果的符合程度及用同一種方法進(jìn)行多次測(cè)定的結(jié)果能否重現(xiàn)的問(wèn)題[2]。國(guó)際上，主要依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）EP12-2A文件公布的2種定性檢測(cè)方法的一致性比較[3-4]。國(guó)內(nèi)對(duì)獸用診斷制品的技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要參考農(nóng)業(yè)部第 683 號(hào)公告有關(guān)規(guī)定進(jìn)行，常采用對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)試劑盒的敏感性、特異性和符合率。其計(jì)算公式如下：敏感性= （與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清檢測(cè)結(jié)果一致的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清總份數(shù)） ×100%；特異性 = （與標(biāo)準(zhǔn)陰性血清檢測(cè)結(jié)果一致的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)陰性血清總份數(shù)）×100%；符合率 = （與標(biāo)準(zhǔn)血清檢測(cè)結(jié)果一致的血清份數(shù)/標(biāo)準(zhǔn)血清總份數(shù)） ×100%[5]。筆者認(rèn)為，獸醫(yī)診斷試劑對(duì)Kappa一致性檢驗(yàn)的應(yīng)用，應(yīng)加以重視和借鑒。

3.2 試劑盒選擇

Kappa值主要體現(xiàn)兩種不同試劑或方法檢測(cè)結(jié)果的一致性，但不能判定哪個(gè)試劑盒或方法較好。Kappa值越大，兩者一致性越高，則表明結(jié)果可靠程度越高[1]?？勺鳛闄z測(cè)試劑或方法檢測(cè)結(jié)果的可靠程度的參考。判定試劑盒的主要指標(biāo)主要以對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，判定其敏感性和特異性。由于目前國(guó)內(nèi)缺乏豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，常無(wú)法做出判斷。從本次試驗(yàn)的結(jié)果看，兩種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果中度一致，這與吳雪軍等報(bào)道的基本一致[6]。因此，建議根據(jù)實(shí)際情況選擇不同的試劑盒。

[1]Landis JR，Koch GG.The measurement of observer agreement for Gategorical data[J].Biometrics，1977，33：159-174.

[2]張波. Kappa一致性檢驗(yàn)在流行病學(xué)中的應(yīng)用舉例[J].寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，17（4）：336-337.

[3]夏邦世，吳金華. Kappa一致性檢驗(yàn)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，29（1）：83-84.

[4]宋斌斌，趙瀛，張春燕，等.兩種抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體檢測(cè)方法的結(jié)果比較[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26（7）：457-460.

[5]吳華偉，高金源，鄧永，等. 國(guó)內(nèi)5種豬圓環(huán)病毒PCV2抗體檢測(cè)試劑盒的比較試驗(yàn)[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2011，45（6）：11-12，15.

[6]吳雪軍，周彩琴，趙靈燕，等. 檢測(cè)豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒抗體的兩種ELISA方法的比較及其應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，48（4）：27-29.

Application of Kappa Test for Evaluation of PRRSV Antibody ELISA Kits

Liu Hua，Zhan Songhe，He Changsheng，Zhu Liangqiang

（Anhui Center for Animal Disease Prevention and Control，Hefei，Anhui 230061 ）

Objective To compare the consistency between the results of the PRRSV antibody ELISA Kits produced by 2 frms. Method 390 swine serum samples were tested by the PRRSV antibody ELISA kits produced by two different frms. The consistency between the results of the 2 different kits was compared by means of Kappa test. Results 250 positive and 70 negative were tested by the 2 kits together．The positive consistency rate was 80.65%，and the negative consistency rate was 87.50%，and the coincidence rate was 82.1%. The consistency was moderate （Kappa=0.552）. Conclusion：The results showed a good consistency between the 2 kits，both could be used for PRRSV antibody detection，and it just depends on the actual needs.

porcine reproductive and respiratory syndrome；ELISA kit；comparison；Kappa test

S858.28

：B

：1005-944X（2014）11-0095-03

朱良強(qiáng)