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    剛地弓形蟲肌動蛋白解聚因子/絲切蛋白家族的研究進展

    2014-01-25 15:34:02李潤花李雅清殷國榮
    中國人獸共患病學報 2014年11期
    關(guān)鍵詞:肌動蛋白弓形蟲激酶

    李潤花,李雅清,殷國榮

    肌動蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor,ADF)/絲切蛋白(cofilin)家族是一類肌動蛋白結(jié)合蛋白,廣泛存在于真核細胞中。迄今為止,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種肌動蛋白結(jié)合蛋白,其中ADF/cofilin(AC)被認為有著重要作用。1980年,Bamburg等首次從雞胚的腦組織中發(fā)現(xiàn)并提純出AC蛋白[1]。AC蛋白是調(diào)節(jié)微絲翻轉(zhuǎn)必不可少的纖維狀肌動蛋白(Fibros-actin,F(xiàn)-actin)與球形肌動蛋白(Globular-actin,G-actin)結(jié)合蛋白。Cofilin主要通過切斷肌動蛋白絲(actin filaments,AF)來增加肌動蛋白解聚作用,而ADF則通過螯合ATP-肌動蛋白單體從而促進F-actin向G-actin的轉(zhuǎn)換來維持動力。兩者在重塑肌動蛋白骨架中起重要作用,其中一種蛋白的缺失可由另一種蛋白來彌補[2]。寄生性原生侵入宿主細胞與肌動蛋白骨架重塑密切相關(guān)[3]。瘧原蟲生活周期的轉(zhuǎn)化、克氏錐蟲侵入宿主、侵襲性阿米巴的脫囊、剛地弓形蟲速殖子滑動以及利什曼原蟲的發(fā)育在一定程度上均與AC蛋白的含量成正相關(guān)[4-6]。

    剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)屬于頂端復(fù)合門,是一種專性胞內(nèi)寄生蟲,可感染侵入大多數(shù)溫血動物宿主的有核細胞。頂端復(fù)合門寄生原蟲是以依賴于肌動蛋白絲的滑行運動(gliding motility)為基礎(chǔ)穿越生物屏障侵入宿主細胞,而滑行運動是剛地弓形蟲侵入細胞的獨特運動形式[3]。寄生蟲在滑動時肌動蛋白絲快速組裝和翻轉(zhuǎn),以提供其侵入的動力。然而到目前為止,寄生蟲滑行所依賴的微絲翻轉(zhuǎn)特性尚未得到充分的解釋。有研究表明,弓形蟲侵入宿主細胞時,98%的肌動蛋白為球形肌動蛋白(G-actin),即肌動蛋白單體維持其運動狀態(tài)。弓形蟲肌動蛋白解聚因子(TgADF)通過調(diào)節(jié)弓形蟲肌動蛋白動力學,從而在其侵入宿主中發(fā)揮重要作用,可抑制TgADF可阻止弓形蟲持久的滑行運動,降低其侵入宿主的移動速度。近年來,通過基因重組構(gòu)建TgADF重組體成為弓形蟲疫苗候選抗原的研究方向[7]。

    1 AC蛋白家族的結(jié)構(gòu)特點

    AC蛋白家族主要包括ADF、cofilin1和cofilin2,雖然他們的氨基酸數(shù)量及序列不盡相同,但其蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)相似性很大[1]。這是由于ADF/cofilin基因的外顯子與內(nèi)含子交界區(qū)序列在不同物種間高度保守,通過選擇性剪接對其進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,最終產(chǎn)生相同的多肽[8]。AC蛋白家族的大小從113個氨基酸到168個氨基酸不等。ADF具有一個相當保守的長α-螺旋,可與肌動蛋白結(jié)合并促使其解聚,稱為ADF同源區(qū)(ADF-H)。ADF-H也存在于在其他的肌動蛋白結(jié)合蛋白中,如肌動蛋白結(jié)合蛋白1(actin binding protein 1,ABP1)、肌連腦蛋白、雙絲蛋白等。此外,ADF具有一段Trp100/Met115序列,可結(jié)合磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2),在ADF與肌動蛋白的相互作用過程中十分重要。然而有研究證實,剛地弓形蟲ADF(TgADF)不與PIP2結(jié)合,因而PIP2并不能影響TgADF與G-actin的相互作用[9]。真核生物AC蛋白家族是一類低分子量肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白。單細胞真核生物僅含有一個或兩個AC蛋白,而多細胞有機體,如小鼠含有多個AC蛋白[10]。TgADF含有118個氨基酸,與其他低分子量肌動蛋白單體分離蛋白具有高度同源性,如阿米巴屬的載肌動蛋白、植物ADF、酵母及脊椎動物絲切蛋白。

    通過Southern blot檢測表明,TgADF由一段單拷貝基因編碼,屬于功能亞型的AC蛋白。通過免疫熒光及免疫電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)TgADF主要定位于速殖子質(zhì)膜下,散落存在于胞漿內(nèi)[11]。與其他生物的ADF相比,TgADF氨基酸序列最短,由于缺乏與F-actin結(jié)合相關(guān)的C端螺旋,而具有低F-actin切斷、高G-actin螯合活性。TgADF含有一段保守的AC蛋白折疊區(qū),此區(qū)域由中央的6個β-折疊,周圍包繞3個α-螺旋和一個C端卷曲組成。在結(jié)構(gòu)和動力學上,G-actin和TgADF表面結(jié)合的G-actin之間的相互作用,在很大程度上決定了TgADF的高G-actin螯合活性。TgADF的G-actin結(jié)合位點構(gòu)象的靈活性直接決定了TgADF與G-actin的親和力。有研究發(fā)現(xiàn),TgADF和兔肌肉G-actin之間相互作用的平衡解離常數(shù)只有23.81nM,顯示出TgADF與G-actin的高親和力[9]。

    2 AC蛋白活性的調(diào)節(jié)

    肌動蛋白絲的解聚和聚合動力學及其骨架重塑成為細胞遷移、粘附、分化等必不可少的因素。AC蛋白可促進肌動蛋白絲解聚分離,在肌動蛋白絲快速翻轉(zhuǎn)和依賴肌動蛋白的細胞骨架重塑過程中扮演重要角色[12]。AC蛋白活性受細胞內(nèi)外信號分子及其自身磷酸化與去磷酸化調(diào)節(jié)。AC蛋白磷酸化酶在肌動蛋白絲動力學中起重要作用,其靶位一般是N末端的Ser-3殘基[13]。Ser-3殘基磷酸化可抑制AC蛋白活性而脫磷酸化可恢復(fù)其活性。細胞中存在一系列分子調(diào)控AC蛋白磷酸化與去磷酸化,從而調(diào)控肌動蛋白骨架重塑。AC蛋白的脫磷酸化依賴于AC蛋白的磷酸酶(SSH)。目前為止,至少有3種蛋白激酶參與調(diào)控AC蛋白的磷酸化過程。有研究證實,LIM結(jié)構(gòu)域蛋白激酶1和2(LIMK1和LIMK2)可磷酸化AC蛋白Ser-3位點[14-15]。Rho家族小G蛋白Rac、Rho、Cdc42均可活化LIM激酶[16-17],由下游效應(yīng)分子p21激酶和Rho相關(guān)激酶介導(dǎo),分別磷酸化LIMK1的508位和LIMK2的505位蘇氨酸[18]。而熱休克蛋白90(HSP90)可通過二聚化和磷酸轉(zhuǎn)移途徑調(diào)控LIMKs水平。同時泛素連接酶Rnf6可降解LIMKs。睪丸特異性激酶1(TESK1)是一種絲蘇氨酸激酶,N末端含一個蛋白激酶區(qū),C末端是一個富含脯氨酸域[19]。TESK1和LMK類似,可磷酸化AC蛋白Ser-3位點,誘導(dǎo)肌動蛋白張力纖維形成[20]。不同的是,TESK1的活性由整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的信號通路調(diào)控,并不是p21激酶和Rho相關(guān)激酶[20]。

    依賴LIMKs、TESKs調(diào)節(jié)AC蛋白活性在弓形蟲尚未見報道。而剛地弓形蟲脫氧核糖磷酸醛縮樣酶(TgDPA)被發(fā)現(xiàn)可提高TgADF蛋白活性。通過免疫共沉淀和GST-速冷點法測定TgDPA和TgADF的相互作用,發(fā)現(xiàn)加入GST-TgDPA可降低肌動蛋白聚合度、加速肌動蛋白絲解聚。AC蛋白對于肌動蛋白的聚合及解聚活性也依賴于pH調(diào)節(jié)[21],這一點在剛地弓形蟲和人均有報道[11,21]。ADF對pH的依賴性要高于絲切蛋白,一般而言,在低pH環(huán)境下可以增強AC蛋白穩(wěn)定肌動蛋白的能力,pH<7.1時可抑制AC蛋白對肌動蛋白的解聚作用,pH升高時可快速解聚肌動蛋白、增強其與肌動蛋白單體結(jié)合的能力。研究發(fā)現(xiàn),小鼠胚胎成纖維細胞胞漿內(nèi)pH從7.4降到6.6時,ADF含量從42%降至23%[22]。然而不同生物體AC蛋白的pH依賴性并不一致,如阿米巴屬的載肌動蛋白和酵母絲切蛋白均不受pH影響。此外,還原劑谷胱甘肽可使cofilin二聚化而失去解聚活性[23],如T細胞cofilin,因其半胱氨酸位點被谷胱甘肽氧化形成分子內(nèi)二硫鍵而失去解聚活性,從而增加了肌動蛋白絲的水平[24]。

    3 AC蛋白參與調(diào)控肌動蛋白動力學機制

    AC蛋白可增強肌動蛋白絲翻轉(zhuǎn)因而被稱為肌動蛋白動力學蛋白。AC蛋白對肌動蛋白的動力學影響及調(diào)控機制復(fù)雜多樣,不僅與肌動蛋白絲而且與球狀肌動蛋白結(jié)合,既可促進肌動蛋白聚合也可促進肌動蛋白絲解聚[25-26]。Roland等[27]建立的肌動蛋白動力學模型表明,AC蛋白通過兩方面發(fā)揮解聚活性,一是切斷肌動蛋白絲,二是增強肌動蛋白單體離開肌動蛋白絲末的速率。AC蛋白與沿著長螺距螺旋的肌動蛋白亞單位相互作用,解聚肌動蛋白絲還是聚合肌動蛋白取決于AC蛋白與肌動蛋白的摩爾比。當肌動蛋白絲中AC蛋白與肌動蛋白比<1∶100時,肌動蛋白絲持續(xù)切割而解聚;比例上升至1∶10到1∶2時,肌動蛋白絲短暫切割而使其穩(wěn)定在一種扭曲狀態(tài);比例繼續(xù)上升,當AC蛋白過量時,肌動蛋白不再被切割而維持聚合狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn),當絲切蛋白濃度很高時,可促進肌動蛋白單體聚合、核酸合成以及肌動蛋白組裝[28]。

    與其他真核生物不同,頂端復(fù)合門寄生蟲的AC蛋白家族成員缺乏F-actin結(jié)合位點,但其仍舊可以促進肌動蛋白絲分解[3]。重建C端F-actin結(jié)合位點反而降低網(wǎng)狀微絲的解聚活性。通過免疫熒光和電子顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn),抑制TgADF可導(dǎo)致肌動蛋白絲累積,從而降低弓形蟲移動速度、增加異常移動形式、抑制持久的滑行運動。TgADF是一種弱切割蛋白,需要更高的濃度才可以達到諸如其他AC蛋白解聚肌動蛋白的效應(yīng)。但同時,由于TgADF的強肌動蛋白單體螯合活性,在極低濃度時即可抑制弓形蟲肌動蛋白的聚合。TgADF與G-actin結(jié)合,降低G-actin的濃度,促使F-actin向G-actin的轉(zhuǎn)變,從而加速肌動蛋白絲解聚翻轉(zhuǎn)。在高濃度G-actin環(huán)境下,TgADF的作用尤為明顯。

    4 AC蛋白作為弓形蟲疫苗候選抗原的可能性

    AC蛋白家族通過調(diào)節(jié)微絲翻轉(zhuǎn)重塑細胞骨架,從而影響細胞生長、發(fā)育和分化。家族成員ADF在寄生蟲運動、粘附及入侵宿主過程中起重要作用,因此其成為許多寄生蟲疾病候選疫苗研究的熱點[29]。早在1997年Allen等[11]就已經(jīng)克隆表達出剛地弓形蟲ADF,研究了TgADF與調(diào)控肌動蛋白解聚的關(guān)系,并提出抑制TgADF阻遏弓形蟲入侵宿主的可能。隨后,通過重組剛地弓形蟲ADF免疫小鼠觀察其免疫保護性的研究越來越多。2009年黃祥盛[30]構(gòu)建pET28a(+)-TgADF重組質(zhì)粒和重組ADF蛋白分別免疫小鼠,通過檢測T細胞數(shù)量和腦內(nèi)蟲荷研究弓形蟲ADF的免疫保護性。2011年Li等[7]用pVAX1-TgADF重組質(zhì)粒免疫小鼠,腦內(nèi)減蟲率達42.8%。TgADF作為弓形蟲疫苗候選抗原成為了可能,在抗弓形蟲感染中具有一定的作用。

    綜上所述,隨著結(jié)構(gòu)生物學及體外分析等各種技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用,對AC蛋白家族的結(jié)構(gòu)、氨基酸序列、功能、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等各個方面的研究越來越深入。對于剛地弓形蟲而言,ADF是其侵入宿主細胞過程必不可少的因素。研究AC蛋白家族作為疫苗候選抗原具有潛在的價值。

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