絳蟲種的分類鑒定方法研究進展

范彥雷，婁忠子，李 立，閆鴻斌，賈萬忠

絳蟲屬扁形動物門絳蟲綱，營寄生生活，其成蟲和幼蟲分別寄生于不同宿主，但也有寄生于同一宿主體內者(如豬帶絳蟲)。對人體及動物危害較為嚴重的是絳蟲的幼蟲，蟲卵進入中間宿主后經血液循環(huán)到達適宜部位發(fā)育成囊尾蚴或者包囊，其中屬于帶科(Taeniidae)的帶屬(Taenia)和棘球屬(Echinococcus)絳蟲蚴蟲尤為重要。囊蟲常見于腦室、肌肉、腹腔、胸腔、眼球等部位[1]，是一類危害嚴重的人獸共患寄生蟲病即囊尾蚴病[2]，如豬帶絳蟲和亞洲帶絳蟲，呈世界性分布，尤其在發(fā)展中國家廣泛流行，全球有近百萬人感染[3]。絳蟲的成蟲常寄生于機體的消化道內，對機體主要是機械性損害，損害程度相對于幼蟲而言較輕。

只有部分絳蟲對人及畜禽危害嚴重，大多數(shù)物種并不危害人及經濟動物，因此對這些物種的系統(tǒng)了解相對甚少，但是其作為絳蟲綱的成員，對其進行系統(tǒng)的分類是對絳蟲學研究的一種貢獻，也是為研究其他對人及其經濟動物有危害絳蟲的一種借鑒。因此如何對絳蟲進行準確而系統(tǒng)的分類已經成為眾多學者研究的熱點。同時，及時診斷、有效防治絳蟲病取決于對病原體的準確鑒定。本文就目前已有的確定絳蟲分類方法做一簡要綜述，主要從形態(tài)學、生活史以及分子生物學方法進行闡述，為絳蟲分類工作提供科學依據(jù)。

1 形態(tài)學方法

由于地理位置和生存環(huán)境的差異，物種為了適應環(huán)境，自身的結構將會做出相應的改變，因此觀察其形態(tài)結構的差異是區(qū)分不同物種的直接方式。觀察絳蟲發(fā)育各階段的形態(tài)與已報道過的物種間的差異，包括成蟲(吸附器官、頭節(jié)、生殖器官、成蟲大小)、卵(六鉤蚴)、蚴體(頭節(jié)的數(shù)量和形態(tài))等形態(tài)學特征是鑒定絳蟲的重要手段之一。

1.1成蟲形態(tài) 絳蟲成蟲主要由頭節(jié)、頸節(jié)和體節(jié)組成。頭節(jié)位于蟲體最前端，作為吸附和固定器官，絳蟲種類不同其形態(tài)結構差異很大。圓葉目絳蟲的頭節(jié)膨大呈球形，其上有四個均勻排列的圓形或橢圓型吸盤，如副裸頭屬絳蟲。根據(jù)吸盤上有無小鉤也可將絳蟲進行區(qū)分，裸頭科、帶科絳蟲吸盤上無小鉤，戴文科、雙殼科的吸盤上有或無小鉤。有些種類的頭節(jié)頂端中央有一個頂突，其上有一圈或數(shù)圈排列的小鉤，例如帶科絳蟲其頂突存在內外兩圈排列的角質化小鉤(牛帶絳蟲除外[4])，膜殼科絳蟲頂突上大多具有鉤且呈單圈排列，裸頭科絳蟲頭節(jié)無頂突。假葉目絳蟲頭節(jié)一般呈指形，背腹各有一溝樣吸槽，如寬節(jié)雙葉槽絳蟲。

同一科內不同屬的成蟲長度存在明顯差異，這在帶科絳蟲中區(qū)別比較明顯，如豬帶絳蟲(帶屬)成蟲全長2-5 m；牛帶絳蟲(帶屬)成蟲一般長5-10 m，最長可達25 m；而細粒棘球絳蟲(E.granulosus，Eg，棘球屬)長2-7 mm，多房棘球絳蟲(E.multilocularis，Em，棘球屬)成蟲長僅為1.2-4.5 mm[5]。

此外，蟲體在顏色上也有不同，大多數(shù)絳蟲蟲體呈乳白色，但個別絳蟲存在差異如活體犬復孔絳蟲為淡紅色，貝氏莫尼茨絳蟲蟲體呈黃白色。蟲體生殖器官在同一科不同屬之間也有差異，如大裸頭絳蟲成節(jié)有一組生殖器官，生殖孔開口于一側；莫尼茨屬成節(jié)內有兩組生殖器官，對稱分布于節(jié)片兩側，生殖孔開口于節(jié)片兩側。

Xiao等[6]在四川石渠縣狐貍體內發(fā)現(xiàn)一種絳蟲，其形態(tài)與Em相似，然而這個新物種與Em的差別在于具有小吻鉤、較少的節(jié)片、成熟節(jié)片中生殖孔位置特殊和孕節(jié)中含有較少的蟲卵。這些特征確定其屬于棘球屬但又不同于其它種，最終確定為一個新種—石渠棘球絳蟲(Es)。

1.2幼蟲(蚴)形態(tài) 絳蟲都要經蟲卵發(fā)育成六鉤蚴，再進一步發(fā)育為幼蟲的階段。假葉目絳蟲的幼蟲經歷兩個階段，蟲卵經子宮排除后不會直接感染中間宿主，需要在水中發(fā)育后才能形成具有感染性的六鉤蚴，由于六鉤蚴表面有密布纖毛的胚膜，因此又稱為鉤毛蚴或鉤球蚴，六鉤蚴被第一中間宿主吞食后形成原尾蚴，原尾蚴為實心結構，其前端有一凹陷處，末端有一小尾球，其內有3對小鉤；原尾蚴進入第二中間宿主后發(fā)育成實尾蚴，實尾蚴也具有實心結構，無小鉤，具有成蟲樣頭節(jié)，但無鏈體和生殖器官，如裂頭蚴。

圓葉目絳蟲幼蟲分為似囊尾蚴和囊尾蚴兩種類型。似囊尾蚴為一個含有凹入頭節(jié)的雙層囊狀體，其一端具有尾巴樣結構，如裸頭科絳蟲的蟲卵進入中間宿主地螨體內釋放出六鉤蚴，并逐漸發(fā)育成似囊尾蚴。囊尾蚴為一半透明囊體，囊內充滿囊液，有頭節(jié)凹入。囊尾蚴的形態(tài)隨絳蟲種類有所不同。帶科絳蟲囊尾蚴差異比較明顯，如豆狀囊尾蚴呈卵圓形，大小6～12 mm×4～6 mm，僅有一個頭節(jié)；腦多頭蚴為乳白色半透明的囊泡，呈圓形或卵圓形，直徑達5 cm或更長，囊壁上含有100個左右的原頭蚴；細粒棘球蚴囊體可以產生無數(shù)個生發(fā)囊，每個生發(fā)囊又可產生許多原頭蚴；鏈狀囊尾蚴頭節(jié)則與囊泡之間形成很長的鏈體。

形態(tài)學在絳蟲物種鑒定中起到了指引作用，通過形態(tài)學的分析能夠快速鑒定出其所屬的科、屬等分類地位，為進一步鑒定奠定了基礎。Malsawmtluangi等[7]在印度東北部爆發(fā)嚙齒動物囊尾蚴時，對采集到的囊尾蚴的形態(tài)進行分析確定為帶科帶屬絳蟲的中絳期幼蟲，為分子生物學鑒定的引物設計提供了基礎。然而單純依靠形態(tài)學上的差別有時并不能完全區(qū)分兩個物種，例如亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲，其形態(tài)學幾乎完全相似，因此長時間被認為是同一個物種，直到對其線粒體基因組測序后才發(fā)現(xiàn)它們屬于兩個不同的種[8-9]。

2 生活史、宿主范圍、流行病學調查及生態(tài)學等方法

2.1生活史及宿主范圍 絳蟲發(fā)育比較復雜，不同物種間其生活史、宿主范圍存在差異，在其生活史中絕大多數(shù)需要一個或兩個中間宿主，個別寄生于人類和嚙齒動物的絳蟲不需要中間宿主，如：短小膜殼絳蟲。假葉目絳蟲由于卵殼厚，蟲卵排除后不具有直接的感染性，需要經過兩個中間宿主才能最終感染終末宿主；圓葉目絳蟲卵殼較脆弱，沒有卵蓋，在蟲卵脫離母體后，六鉤蚴已經形成，因此可以直接感染中間宿主，只需一個中間宿主。廣義的細粒棘球絳蟲種內變異現(xiàn)象突出，已發(fā)現(xiàn)的基因型(genotype)或蟲株(strain)至少10個：G1-G10以及獅棘球絳蟲(E.felids)，其中間宿主和終末宿主范圍及特異性上均存在著差別[10]。一些學者已建議將其中一部分基因型或者蟲株單獨列為種[11]。同時，地理位置的不同可能造成同一種絳蟲幼蟲存在宿主多樣性，Kataranovski等[12]報道巨頸絳蟲(T.taeniaeformis)幼蟲根據(jù)地理位置不同可以改變其寄生所需的中間宿主。

2.2流行病學 寄生蟲病流行病學調查內容包括：生物因素、自然因素和社會因素。生物因素主要指寄生蟲與宿主等因素，絳蟲大多需要一個或兩個中間宿主，其宿主的分布及范圍因不同物種而存在差異；自然因素包括氣候、地理和生物種群等，直接影響著寄生蟲的分布和流行，如棘球蚴病(包蟲病)作為一種地方性流行病，在我國西北牧區(qū)普遍流行，這與當?shù)氐纳锓N群(牛、養(yǎng)、嚙齒動物及犬科動物)密不可分；社會因素包括社會經濟狀況、文化教育和科學技術水平、法律法規(guī)的制定和執(zhí)行、人們的生活方式、風俗習慣等，如我國部分地區(qū)當?shù)鼐用裼惺成獾牧晳T，這往往導致豬囊蟲病的流行[5]。

絳蟲病流行病學調查的主要參考因素：寄生宿主、部位和感染率。以三種人體帶絳蟲(豬帶絳蟲、亞洲帶絳蟲及牛帶絳蟲)為例，豬作為豬帶絳蟲和亞洲帶絳蟲的主要傳播中間宿主，人類因分別誤食含有其幼蟲的豬肉(豬帶絳蟲蚴寄生部位)和肝臟(亞洲帶絳蟲蚴寄生部位)而被感染[13]， Hosseinzadeh[14]等報道牛帶絳蟲幼蟲主要寄生于牛的咬肌、心臟、膈肌，根據(jù)宿主和寄生部位的不同可以快速將這三種人體帶絳蟲種類鑒定出來。此外，在進行流行病學調查時需要注意，地域差異可以導致不同的感染率，Kataranovski等[12]在西伯利亞野生溝鼠(Ratusnorvegicus)體內檢測帶狀囊尾蚴(Cysticercusfasciolaris，巨頸帶絳蟲[T.taeniaformis]的幼蟲)感染率為29.9%；Wanas等[15]發(fā)現(xiàn)埃及嚙齒動物(黑鼠、小家鼠、沙鼠)帶狀囊尾蚴廣泛流行(25%～41%)，而在美國嚙齒動物中帶狀囊尾蚴流行率較低(6%～18%)[16-18]。選擇不同的地區(qū)進行流行病學調查所得感染率結果可能有存在出入，因此在對絳蟲物種進行分類鑒定時要選擇一定的地理位置進行流行病學分析。

2.3生態(tài)學 生態(tài)學在絳蟲分類鑒定上的應用有助于快速尋找其宿主范圍，主要是指物種間食物鏈的關系。自然界生物間均存在著捕食與被捕食的關系，食草動物一般作為肉食動物的獵物，這為寄生蟲的發(fā)育繁殖提供了很好的便利條件。肉食動物在捕食獵物時有其偏愛性，藏狐在青藏高原上主要以高原屬兔為食，這兩者之間形成食物鏈的一枝，因此在野生環(huán)境下以高原屬兔為中間宿主的多房棘球蚴和石渠棘球蚴其終末宿主往往是藏狐。而細粒棘球蚴常寄生于牛羊的肝臟和肺臟，在自然條件下，狼捕食牛羊，成為了細粒棘球絳蟲的終末宿主；同時隨著人類活動的干涉，牛羊作為經濟動物飼養(yǎng)，在屠宰過程中發(fā)現(xiàn)有病變的臟器便喂給家養(yǎng)的狗，于是狗進入了細粒棘球絳蟲的生活史。

3 免疫學方法

免疫學方法在診斷病原方面具有簡單、快速等優(yōu)點，常用方法有酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、糞抗原ELISA(Copro-Ag ELISA)和免疫印跡法(IB)。目前，針對對人及家畜危害嚴重的棘球屬絳蟲傳染源(犬等終末宿主)檢測開發(fā)了特異性的糞抗原ELISA檢測方法[19]，Hartnack等[20]利用糞抗原ELISA檢測糞樣中多房棘球絳蟲和細粒棘球絳蟲，靈敏性分別為55%和57%，特異性分別為76%和85%。盡管免疫學試驗存在低靈敏性和交叉反應等缺點，如豬囊蟲的血清(免疫)學試驗與細頸囊尾蚴感染(泡狀帶絳蟲T.hydatigena的幼蟲)之間存在交叉反應[21]，但針對抗原的ELISA和IB在非洲等國家仍然作為豬囊蟲流行病學調查的主要手段[21]。帶屬絳蟲糞抗原ELISA作為一種非商品化的診斷試劑盒具有相對于針對抗體的ELISA更高的靈敏性并在一些研究中得到了應用[22]，但診斷人囊尾蚴病時，IB的敏感性卻高于糞抗原ELISA[23]。免疫學方法的建立為臨床上快速、準確地診斷絳蟲病病原提供了基礎，只能檢測已知蟲種，對未知蟲種的鑒定方面存在缺陷。

4 分子生物學方法

4.1常規(guī)PCR及測序技術 隨著PCR的普遍應用及測序技術的發(fā)展，不同蟲種及同種不同分離株的絳蟲線粒體基因和核基因序列愈來愈多地被提交到GenBank數(shù)據(jù)庫，尤其是近年來對絳蟲線粒體基因組和核基因組測序工作的完成，為人們從基因水平對絳蟲分類鑒定提供大量豐富的數(shù)據(jù)，因此也成為了眾多學者研究的焦點。目前完成的絳蟲線粒體全基因組序列共32個，其中帶屬16個種，棘球屬5個種(包括10個基因型)，膜殼屬1個種，裸頭科4個種，雙殼科1個種，迭宮屬1個種，雙葉槽屬2個種，復殖孔屬2個種；核基因組5個。

4.1.1線粒體基因在絳蟲分類鑒定中的應用 線粒體作為真核細胞特有的器官存在于細胞質中，包含生物體呼吸氧化所需酶的編碼基因，在細胞內代謝旺盛，當外界環(huán)境改變時，其所攜帶的遺傳信息較易發(fā)生改變，線粒體DNA以高頻率發(fā)生突變，其突變頻率是核DNA的10倍；此外，線粒體攜帶極少的非編碼區(qū)DNA，無內含子，其進化速度較核基因組迅速，因此常在分類學中得到應用[24]。研究線粒體基因序列變異，為人們從分子水平上對物種進行細致分類鑒定提供了很好的工具。目前，線粒體基因已廣泛應用于蟲種、蟲株的鑒定和鑒別，建立臨床樣品分子生物學診斷方法和發(fā)展檢測技術，研究物種起源與進化和比較基因組學研究等。

絳蟲mtDNA為雙鏈閉環(huán)分子，核苷酸數(shù)目在13.4kb-13.8kb之間，共有36個編碼基因，其中編碼蛋白質的基因有12個，編碼tRNA的基因22個，編碼rRNA的基因2個，約60%編碼蛋白質的基因編碼NADH-Q還原酶的7個亞基(nad1-6及nad4L)，其余的用于編碼細胞色素還原酶的一個亞基(cob)、細胞色素氧化酶的3個亞基(cox1-3)以及ATP合成酶的一個亞基(atp6)。

線粒體基因組做為分子遺傳標記在絳蟲物種的分類鑒定中得到了普遍應用，Xiao等[6]在我國四川石渠縣發(fā)現(xiàn)的一種絳蟲，對其線粒體nad1、cox1、atp6、cob、rrnL基因序列分析后，發(fā)現(xiàn)該絳蟲不同于棘球屬的其他種，并根據(jù)發(fā)現(xiàn)地命名為石渠棘球絳蟲。Malsawmtluangi等[7]在印度東北部米佐拉姆邦地區(qū)收集的嚙齒動物囊尾蚴，對其形態(tài)學特征、核糖體DNA(ITS1，ITS2)以及線粒體cox1進行測序分析，確定其為帶狀囊尾蚴。此外線粒體基因序列在細粒棘球蚴10個基因型的分離鑒定中起到了關鍵作用，這10個基因型在蟲體形態(tài)、幼蟲形態(tài)、宿主特異性(范圍)、地理分布、致病性方面均存在差異，線粒體序列將這10個基因型準確分類，打破了以往對細粒棘球絳蟲種認識的局限性，為以后的防治和研究工作奠定了基礎；Jeon等通過對這亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲的線粒基因組全序列的測定，比對分析結果表明這兩種絳蟲線粒體基因組核苷酸序列的差異為5.6%，與豬帶絳蟲(T.solium)線粒體基因組序列的差異為 11%，最終確定了亞洲絳蟲的獨立種地位及這3種絳蟲的親緣關系，為臨床診斷和防治等工作奠定了基礎[8,25-27]。

然而，線粒體基因哪部分可以作為理想的分子靶標來區(qū)分物種，長期困擾著研究絳蟲分類鑒定的學者，傳統(tǒng)分子生物學鑒定主要依靠nad1和cox1序列的比對分析，但這并不代表nad1和cox1序列是線粒體基因中變異程度最大的，而是因為這些基因兩端臨近部位存在保守區(qū)域，為引物的設計提供了很好的位點[28]。在棘球屬中nad1的變異率要大于cox1，McManus等[29]對細粒棘球蚴的11個基因型種內及與多房棘球蚴、少節(jié)棘球蚴和福氏棘球蚴種間的cox1序列進行比較發(fā)現(xiàn)差異分別為5%～9%和6%～11.5%，而nad1序列差異分別為7%～15%和13%～16%。大量文獻表明，nad1和cox1序列在線粒體基因上的變異程度并沒有其他基因大，Xiao等[6]分析了Es與Em和Eg(G1型)線粒體上5個基因nad1(897 bp)、cox1(1608 bp)、atp6(513 bp)、cob(1608 bp)、rrnL(985 bp)，發(fā)現(xiàn)種間差異最小的是cox1(分別為：7.8%～10.6%)，而差異最大的則是atp6(分別為：18.4%～22.1%)；同時，Jia等[30]對帶屬中的7個種的線粒體全序列利用DnaSP v.5軟件進行了變異程度統(tǒng)計，結果表明nad5差異程度最高，其次是nad6、atp6等，與以往報道過差異較大的基因(nad6、nad5、atp6、nad3、nad2)相吻合。然而存在的問題是，這些變異程度較大的序列是否在同一個物種不同分離株間也存在著較大的差異，是否可以作為絳蟲分類鑒定的依據(jù)還需進一步驗證。隨著不同絳蟲蟲種線粒體全基因組序列的增加，將有助于尋找絳蟲分類鑒定工作中理想的分子靶標基因。

4.1.2核基因在絳蟲分類鑒定上的應用 核基因存在于真核生物的細胞核內，在絳蟲分類鑒定時常用基因為核糖體RNA基因以及衛(wèi)星DNA序列。后者以其高突變率越來越受到研究學者的青睞，尤其是在鑒定種間差異和隱藏種中得到越來越多的應用[31-34]，如Em中極微的遺傳變異都能被檢測到[33]。

4.1.2.1核糖體RNA基因(rRNA) 核糖體RNA基因組成依次為18S、ITS1、5.8S、ITS2和28S，其中ITS被5.8S隔開，分成ITS1和ITS2。28S和18S分別參與核糖體大小亞基的組成。ITS的變異頻率較5.8S、18S及28S都高，在進行屬間進化分析時常用到5.8S、18S及28S作為輔助參考數(shù)據(jù)；種間區(qū)分時則不常使用，而是常用ITS(ITS1和ITS2)，其中ITS1的變異程度要大于ITS2。Drogemuller等[35]對葉狀裸頭科絳蟲(A.perfoliata)和侏儒副裸頭絳蟲(P.mamillana)的ITS、5.8S、18S及28S序列擴增并進行分析，結果表明，5.8S、18S及28S序列具有很高的相似性，而ITS相似度較低，ITS1和ITS2的一致性分別為39.8%～43.5%和59.5%～61.2%。

4.1.2.2衛(wèi)星DNA序列 真核生物基因組中復性最快的組分是由很短的串聯(lián)重復序列拷貝構成的較大序列簇，重復序列的堿基組成與基因組的平均組成有較大差別，其浮力密度不同，這些序列能夠形成獨立的條帶，這樣的條帶就是衛(wèi)星DNA。根據(jù)短重復序列單位長度不同分為微衛(wèi)星序列(長度小于10 bp)和小衛(wèi)星序列(長度在10～100 bp)。衛(wèi)星DNA位于異染色質區(qū)域，定位于著絲粒處。個體基因組微衛(wèi)星或小衛(wèi)星序列間存在著差異，小衛(wèi)星序列中發(fā)生遺傳交換的頻率很高，為10-4/kb DNA，是衛(wèi)星序列間重組頻率的10倍，小衛(wèi)星DNA序列的高度變異性可用來清楚地研究種間的遺傳關系，目前在絳蟲分類上微衛(wèi)星或小衛(wèi)星序列也已經得到應用，這為區(qū)分差異較小的物種提供了新的手段和方法。微衛(wèi)星序列作為分子遺傳標志具有3個重要的特征：敏感性、重復性和強大的區(qū)分性[36-38]。

了解Em的種群動態(tài)對制定防控策略是非常重要的，Em從常規(guī)遺傳學標志來看是非常保守的，而其微衛(wèi)星序列方面存在明顯差異。Em微衛(wèi)星序列(EmsB)，由CA和GA重復序列組成，目前已經作為一個新的工具研究Em的遺傳多樣性，Knapp[39]等利用EmsB對歐洲Em流行地區(qū)的樣品進行了分析，發(fā)現(xiàn)阿爾皮斯山北部流行地區(qū)相對于其他地區(qū)存在較高的遺傳差異。同時EmsB在細粒棘球絳蟲分類中也得到了應用，Maillard[40]等對采自6個不同的國家樣品進行了分析，依據(jù)傳統(tǒng)線粒體序列(nad1和cox1)可將這些樣品分為三個大類，而EmsB分析結果則顯示更加深度的遺傳差異并能區(qū)分小范圍內的變異。

4.1.2.3其他核DNA序列 其他核DNA序列在絳蟲分類上應用較多的為：RNA 聚合酶Ⅱ第二亞基基因 (rpb2)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因(pepck)和DNA聚合酶δ亞基基因(pold)。由于絳蟲屬自體受精，因此這些基因位點上很少發(fā)生異體雜交現(xiàn)象[41]，但這些序列數(shù)據(jù)比較缺乏，目前僅主要應用于絳蟲系統(tǒng)進化分析的研究。帶科絳蟲主要包括帶屬和棘球屬兩個屬，這兩個屬對人及動物健康構成嚴重威脅。棘球屬由于其相似的形態(tài)學、發(fā)育特征和基因組分而獨立成一個屬。為了研究這兩個屬之間的進化關系，分子標志信息的比較是唯一區(qū)分它們的方法，Knapp等[42]選擇編碼蛋白質的3個核基因rpb2、pepck和pold作為遺傳學標志，利用貝葉斯推理構建進化樹進行分析， 結果顯示帶屬并不是包括全部同一祖先后裔在內的單系物種群即為并系群，帶狀帶絳蟲(T.taeniaeformis)、微小帶絳蟲(T.parva)與其他所有帶屬種及棘球屬分類群呈“姊妹”關系，而T.mustelae則與棘球屬呈“姊妹”關系 。Saarma等[11]通過對棘球屬5段核基因序列包括延伸因子1α基因(ef1)、轉化生長因子β受體激酶基因(tgf)、硫氧還蛋白過氧化物酶基因(th)、鈣網蛋白基因(cal)和埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白樣蛋白基因(elp)的測定，利用貝葉斯推理構建進化關系，得出在棘球屬內核DNA比線粒體DNA能更好地反映出棘球屬絳蟲系統(tǒng)發(fā)育關系，提示線粒體DNA不是唯一用來做進化分析的理想分子靶標。

4.2其他分子生物學方法 在絳蟲病進行流行病學調查和疾病防控時，簡便、快速、靈敏的確定絳蟲物種顯得尤為重要。單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析是基于單鏈DNA片段呈復雜的空間折疊構象，當堿基發(fā)生改變時會使其空間構象發(fā)生改變的原理，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)將構象差異的分子分離開，在絳蟲蟲種鑒定方面得到了應用。Sharbatkhori等[43]采集了148個細粒棘球蚴分離株，對cox1和nad1兩個基因進行了SSCP分析，電泳結果顯示cox1和nad1分別有5個和9個條帶，對這些條帶分別測序后發(fā)現(xiàn)不同條帶的序列都存在差異，甚至單核苷酸的差異也能很容易被檢測出來。SSCP分析技術以其高靈敏性在絳蟲分類鑒定中起到快速定種的作用，為人們在進行臨床檢查是提供了方便。此外，多位點酶電泳法(MEE)和限制性片段長度多態(tài)性分析技術(RFLP)作為分子方法同樣有助于對寄生于不同宿主的細粒棘球蚴種的鑒定和描述[44]。

5 種間雜交在絳蟲分類鑒定上應用

目前對自然條件下扁形動物門寄生蟲種間雜交了解甚少，分子遺傳學證據(jù)表明在吸蟲綱分體科部分吸蟲存在種間雜交現(xiàn)象[45]。核DNA作為分子遺傳標志可以鑒定物種間雜交的重要依據(jù)，常用序列有ef1、elp、mdh、EgAgB4。elp基因編碼三個緊密相關的蛋白質：埃茲蛋白、根蛋白、膜突蛋白，最早因作為哺乳動物細胞皮質的構成元件而被發(fā)現(xiàn)，主要分布在肌動蛋白豐富的表面結構(如：微絨毛、絲狀偽足及細胞膜皺褶部位)。

亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲因其極相似的形態(tài)學而長時間被認為是同一個物種，線粒體序列將亞洲帶絳蟲從牛帶絳蟲中分離出來成為一個獨立的物種，但兩個物種間存在著雜交關系。Okamoto等[46]報道ef1有3個等位基因(ef1A、ef1B和ef1C)，ef1A和ef1B存在于亞洲帶絳蟲，ef1C存在于牛帶絳蟲；elp基因有4個等位基因(elpA、elpB、elpC和elpD)，其中elpA和elpB起源于亞洲帶絳蟲，elpC和elpD起源于牛帶絳蟲。Yamane等[47]從我國四川青藏高原分離5株人體帶絳蟲(Taeniaspp.)，對其核基因ef1和elp測序結果發(fā)現(xiàn)其中兩株成蟲是源于亞洲帶絳蟲和牛帶絳蟲的雜交；Xiao等[4]分析石渠棘球絳蟲elp發(fā)現(xiàn)其與其他棘球屬絳蟲種之間不存在雜交現(xiàn)象。目前的研究建議將一些不同細粒棘球蚴分離株歸為單獨種，但是缺少核基因分子標志數(shù)據(jù)，Badaraco等[48]對不同地區(qū)細粒棘球蚴分離株(G1、G2、G5、G6和G7)的mdh和EgAgB4基因進行分析，mdh含有3個等位基因(MD1-MD3)，EgAgB4有兩組序列(EgAgB4-1和EgAgB4-2)，在G1和G2基因型(蟲株)單倍體中等位基因MD1、MD2和EgAgB4-1出現(xiàn)頻率較高，G5、G6和G7基因型(蟲株)單倍體中等位基因MD3和EgAgB4-2出現(xiàn)頻率較高，然而巴西G1分離株則為MD2和MD3的雜合子。絳蟲種間雜交現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為我們在鑒定絳蟲分類鑒定時提供了新的方向，使得絳蟲分類有更加準確的描述成為可能。

6 結 語

絳蟲分類鑒定目前尚無一整套系統(tǒng)完整的方法可以參照。主要依據(jù)其形態(tài)學、生活史、宿主范圍、流行病學調查、生態(tài)學以及分子生物學分析等綜合方面進行鑒定和區(qū)分，這些手段在物種鑒定中都是不可或缺的。形態(tài)學的鑒定可以快速地對某一未知物種進行判斷，為下一步準定定位縮小了范圍，但其缺點就是不能準確定種，尤其是對亞種或隱藏種的發(fā)現(xiàn)，使得形態(tài)學鑒定越來越相形見絀。寄生蟲大多具有宿主特異性，而且呈現(xiàn)區(qū)域性分布，但隨著人類活動的干涉，部分絳蟲的宿主范圍和地理分布呈現(xiàn)擴大趨勢，這對我們根據(jù)已有生活史、宿主范圍、流行病學調查和生態(tài)學資料進行鑒定時起到很大的干擾，研究也表明不同地理位置的同一物種其宿主范圍有很大變化。

隨著分子生物學以及生物信息學的迅速發(fā)展，在絳蟲物種的鑒定方面，越來越趨向于利用基因間的差異。寄生蟲的基因組不會因為環(huán)境、宿主、不同發(fā)育階段以及翻譯后修飾等因素的誘導而發(fā)生變異。不同物種間核基因組和線粒體基因組均存在著遺傳差異，基于DNA序列分析為人們了解全球生物生態(tài)多樣性提供了很好的工具。線粒體基因作為絳蟲物種分類鑒定的熱點，從分子水平上對物種間的遺傳多樣性進行分析，同時由于其高突變率，不同物種間差異較大等特征，一直成為學者們樂于使用的工具，但也存在不足之處，如不同個體間序列差異達到多少時才能證明是屬于不同種；線粒體上哪些基因更適合作為遺傳標志；同一物種不同個體間序列差異多少時才能定為一個亞種或隱藏種等，這些問題將有望隨著線粒體全基因組測序的完成以及深入研究而得到解決。微衛(wèi)星DNA以其高突變率，在絳蟲分類學上作為一種新的工具，幫助我們深度分析種內遺傳變異。

參考文獻：

[1]Zhang XY, Gu JC. Advance in the research of diagnosis and treatment of cysticercosis[J]. China Trop Med, 2009, 9(11): 2188-2191. (in Chinese)

鄭曉燕, 谷俊朝. 囊尾蚴病診治研究進展[J]. 中國熱帶醫(yī)學, 2009, 9(11): 2188-2191.

[2]Prasad KN, Prasad A, Verma A, et al. Human cysticercosis and Indian scenario: a review[J]. J Biosci, 2008, 33(4): 571-582. DOI: 10.1007/s12038-008-0075-y

[3]Garcia HH, Gonzalez AE, Evans CA,et al.Taeniasoliumcysticercosis[J]. Lencet, 2003, 362(9383): 547-556. DOI: 10.1016/S0140-6736(03)14117-7

[4]Fan PC, Lin CY, Chen CC, et al. Morphological description ofTaeniasaginataasiatica (Cyclophyllidea: Taeniidae) from man in Asia[J]. J Helminthol, 1995, 69(4): 299-303. DOI: 10.1017/S0022149X00014863

[5]Wang M. Veterinary parasitology[M]. 3rd ed. Beijing: Chinese Agriculture Publishing House, 2003: 115-120. (in Chinese)

汪明. 獸醫(yī)寄生蟲學[M]. 3版. 北京: 中國農業(yè)出版社, 2003：115-120.

[6]Xiao N, Qiu JM, Nakao M, et al.Echinococcusshiquicusn. sp.,a taeniid cestode from Tibetan fox and plateau pika in China[J]. Int J Parasitol, 2005, 35: 693-701.DOI: 10.1016/j.ijpara.2005.01.003

[7]Malsawmtluangi C, Prasad PK, Biswal DK, et al. Morphological and molecular identification of the metacestode parasitizing the liver of rodent hosts in bamboo growing areas of Mizoram northeast India[J]. Bioinformation, 2011, 7(8): 393-399.

[8]Jeon HK, Eom KS.TaeniaasiaticaandTaeniasaginata: genetic divergence estimated from their mitochondrial genomes[J]. Exp Parasitol, 2006, 113(1): 58-61. DOI: 10.1016/j.exppara.2005.11.018

[9]Hoberg EP. Phylogeny ofTaenia: Species definitions and origins of human parasites[J]. Parasitol Int, 2006, 55: 23-30. DOI: 10.1016/j.parint.2005.11.049

[10]Jia WZ, Yan HB, Ni XW, et al. Progress of the research and application of helminth mitochondria genome[J]. Chin Sci Bull, 2011, 56(28-29): 2358-2372. (in Chinese)

賈萬忠, 閆鴻斌, 倪興維, 等. 蠕蟲線粒體基因組研究及其應用進展[J]. 科學通報, 2011, 56(28-29): 2358-2372.

[11]Saarma U, J?gisalu I, Moks E, et al. A novel phylogeny for the genusEchinococcusbased on nuclear data challenges relationships based on mitochondrial evidence[J]. Parasitology, 2009, 136: 317-328. DOI: 10.1017/S0031182008005453

[12]Kataranovski M, Zolotarevski L, Belij S, et al. First record ofCalodiumhepaticumandTaeniataeniaeformisliver infection in wild norway rats (Rattus norvegicus) in Serbia[J]. Arch Biol Sci, 2010, 62(2): 431-440. DOI: 10.2298/ABS1002431K

[13]Eom KS, Rim HJ. Epidemiological understanding ofTaeniatapeworminfections with special reference toTaeniaasiaticain Korea[J]. Korean J Parasitol, 2001, 39(4): 267-283. DOI: 10.3347/kjp.2001.39.4.267

[14]Hosseinzadeh S, Setayesh A, Shekarforoush SS, et al. An epidemiological survey on the determination ofTaeniasaginatacysticercosis in Iran, using a PCR assay[J]. Vet Rec, 2013, 9. DOI: 10.1136/vr.101269

[15]Wanas MQ, Shehata KK, Rashed AA. Larval occurrence ofHydaltigerataeniaeformisBatsch (1786) (Cestoda: Taeniidae) in the liver of wild rodents in Egypt[J]. J Egypt Societ, 1993, 23(2): 381-388.

[16]Richard H, McBee J. Varying prevalence ofTaeniataeniaeformisstrobilocerci inMicrotuspennsylvanicusof Montana[J]. West N AM Naturalist, 1977, 37(2): 252.

[17]Lochmiller RL, Jones EJ, Whelan JB, et al. The occurrence ofTaeniataeniformisstrobi-locerci inMicrotuspinetorum[J]. J Parasitol, 1982, 68: 975-976.

[18]Theis JH, Schwab RG. Seasonal prevalence ofTaeniataeniaeformis: Relationship to age, sex, reproduction, and abundance of an intermediate host (Peromyscusmaniculatus)[J]. J Wildlife Dis, 1992, 28, 42-50.

[19]Buishi IE, Njoroge EM, Bouamra O, et al. Canine echinococcosis in northwest Libya: assessment of coproantigen ELISA, and a survey of infection with analysis of risk-factors[J]. Vet Parasitol, 2005, 130: 223-232. DOI: 10.1016/j.vetpar.2005.03.004

[20]Hartnack S, Budke CM, Craig PS, et al. Latent-class methods to evaluate diagnostics tests forEchinococcusinfections in dogs[J]. PLoS Negl Trop Dis, 2013, 7(2): e2068. DOI: 10.1371/journal.pntd.0002068

[21]Dorny P, Brandt J, Geerts S. Immunodiagnostic approaches for detectingTaeniasolium[J]. Trends Parasitol, 2004, 20(6): 259-260. DOI: 10.1016/j.pt.2004.04.001

[22]Praet N, Verweij JJ, Mwape KE, et al. Bayesian modeling to estimate the test characteristics of coprology, coproantigen ELISA and a novel real-time PCR for the diagnosis of taeniasis[J]. Trop Med Int Health, 2013, 18(5): 608-614. DOI: 10.1111/tmi.12089

[23]Rodriguez S, Dorny P, Tsang VC, et al. Detection ofTaeniasoliumantigens and anti-T.soliumantibodiesin paired serum and cerebrospinal fluid samples from patients with intraparenchymal or extraparenchymal neurocysticercosis[J]. J Infect Dis, 2009, 199(9): 1345-1352. DOI: 10.1086/597757

[24]McManus DP, Bowles J. Molecular genetic approaches to parasite identification: their value in diagnostic parasitology and systematics[J]. Int J Parasitol, 1996, 26(7): 687-704. DOI: 10.1016/0020-7519(96)82612-9

[25]Jeon HK, Kim KH, Eom KS. Complete sequence of the mitochondrial genome ofTaeniasaginata: Comparison withT.soliumandT.asiatica[J]. Parasitol Int, 2007, 56( 3): 243-246. DOI: 10.1016/j.parint.2007.04.001

[26]Nakao M, Sako Y, Ito A. The mitochondrial genome of the tapewormTaeniasolium: a finding of the abbreviated stop codon U[J]. J Parasitol, 2003, 89(3): 633-635. DOI: 10.1645/0022-3395(2003)089[0633:TMGOTT]2.0.CO;2

[27]Jeon HK, Lee KH, Kim KH, et al. Complete sequence and structure of the mitochondrial genome of the human tapeworm,Taeniaasiatica(Platyhelminthes; Cestoda)[J]. Parasitology, 2005, 130(Pt 6): 717-726. DOI: 10.1017/S0031182004007164

[28]Jia WZ, Yan HB, Guo AJ, et al. Complete mitochondrial genomes ofTaeniamulticeps,T.hydatigenaandT.pisiformis:additionalmolecular markers for a tapeworm genus of human and animal health significance[J]. BMC Genomics, 2010, 11: 447. DOI: 10.1186/1471-2164-11-447

[29]McManus DP. The molecular epidemiology ofEchinococcusgranulosusand cystic hydatid disease[J]. T Roy Soc Trop Med H, 2002, 96(1): 151-157. DOI: 10.1016/S0035-9203(02)90068-4

[30]Jia WZ, Yan HB, Lou ZZ, et al. Mitochondrial genes and genomes support a cryptic species of tapeworm withinTaeniataeniaeformis[J]. Acta Trop, 2012, 123(3): 154-163. DOI: 10.1016/j.actatropica.2012.04.006

[31]Bretaqne S, Assouline B, Vidaud D, et al.Echinococcusmultilocularis: microsatellite polymorphism in U1 snRNA genes[J]. Exp Parasitol, 1996, 82(3): 324-328. DOI: 10.1128/JCM.02107-06

[32]Bart JM, Knapp J, Gottstein B, et al. EmsB, a tandem repeated multi-loci microsatellite, new tool to investigate the genetic diversity ofEchinococcusmultilocularis[J]. Infect Genet Evol, 2006, 6(5): 390-400. DOI: 10.1016/j.mee gid.2006.01.006

[33]Nakao M, Sako Y, Ito A. Isolation of polymorphic microsatellite loci from the tapewormEchinococcusmultilocularis[J]. Infect Genet Evol, 2003, 3(3): 159-163. DOI: 10.1016/S1567-1348(03)00070-4

[34]Bruford MW, Wayne RK. Microsatellites and their application to population genetic studies[J]. Curr Opin Genet Dev, 1993, 3(6): 939-943. DOI: 10.1016/0959-437X(93)90017-J

[35]Drogemuller M, Beelitz P, Pfister K, et al. Amplification of ribosomal DNA of Anoplocephalidae:Anoplocephalaperfoliatadiagnosis by PCR as a possible alternative to coprological methods[J]. Vet Parasitol, 2004, 124(3-4): 205-215.DOI: 10.1016/j.vetpar.2004.07.012

[36]Casulli A, Bart JM, Knapp J, et al. Multi-locus microsatellite analysis supports the hypothesis of an autochthonous focus ofEchinococcusmultilocularisin northern Italy[J]. Int J Parasitol, 2009, 39(7): 837-842.DOI: 10.1016/j.ijpara.2008.12.001

[37]Knapp J, Bart JM, Glowatzki ML, et al. Assessment of use of microsatellite polymorphism analysis for improving spatial distribution tracking ofEchinococcusmultilocularis[J]. J Clin Microbiol, 2007, 45(9): 2943-2950. DOI: 10.1128/JCM.02107-06

[38]Knapp J, Guislain MH, Bart JM, et al. Genetic diversity ofEchinococcusmultilocularison a local scale[J]. Infect Genet Evol, 2008, 8(3): 367-373. DOI: 10.1016/j.meegid.2008.02.010

[39]Knapp J, Bart JM, Giraudoux P, et al. Genetic Diversity of the CestodeEchinococcusmultilocularisin Red Foxes at a Continental Scale in Europe[J]. PLoS Negl Trop D, 2009, 3(6): 452. DOI: 10.1371/journal.pntd.0000452

[40]Maillard S, Gottstein B, Haag KL, et al. The EmsB tandemly repeated multilocus microsatellite: a new tool to investigate genetic diversity ofEchinococcusgranulosussensu lato[J]. J Clin Microbiol, 2009, 47(11): 3608-3616. DOI: 10.1128/JCM.00938-09

[41]Lymbery AJ. Interbreeding, monophyly and the genetic yardstick: species concepts in parasites[J]. Parasitol Today, 1992, 8(6): 208-211. DOI: 10.1016/0169-4758(92)90266-5

[42]Knappa J, Nakao M, Yanagida T, et al. Phylogenetic relationships withinEchinococcusandTaeniatapeworms(Cestoda: Taeniidae): An inference from nuclear protein-coding genes[J]. Mol Phylogenet Evol, 2011, 6: 628-638. DOI: 10.1016/j.ympev.2011.07.022

[43]Sharbatkhori M, Mirhendi H, Jex AR, et al. Genetic categorization ofEchinococcusgranulosusfrom humans and herbivorous hosts in Iran using an integrated mutation scanning-phylogenetic approach[J]. Electrophoresis, 2009, 30(15): 2648-2655. DOI: 10.1002/elps.200900145

[44]McManus DP. Molecular discrimination of taeniid cestodes[J]. Parasitol Int, 2006, 55: 31-37. DOI: 10.1016/j.parint.2005.11.004

[45]Morgan JA, DeJong RJ, Lwambo NJ, et al. First report of a natural hybrid betweenSchistosomamansoniandS.rodhaini[J]. J Parasitol, 2003, 89(2): 416-418. DOI: 10.1645/0022-3395(2003)089[0416:FROANH]2.0.CO;2

[46]Okamoto M, Nakao M, Blair D, et al. Evidence of hybridization betweenTaeniasaginataandTaeniaasiatica[J]. Parasitol Int, 2010, 59(1): 70-74. DOI: 10.1016/j.parint.2009.10.007

[47]Yamane K, Suzuki Y, Tachi E, et al. Recent hybridization betweenTaeniaasiaticaandTaeniasaginata[J]. Parasitol Int, 2012, 61(2): 351-355. DOI: 10.1016/j.parint.2012.01.005

[48]Badaraco JL, Ayala FJ, Bart JM, et al. Using mitochondrial and nuclear markers to evaluate the degree of genetic cohesion amongEchinococcuspopulations[J]. Exp Parasitol, 2008, 119(4): 453-459. DOI: 10.1016/j.exppara.2008.02.004