Array-CGH技術(shù)在產(chǎn)前診斷不平衡染色體改變中的應(yīng)用

宮玉典劉文娟

（1煙臺(tái)市心理康復(fù)醫(yī)院，山東 煙臺(tái)265200；2煙臺(tái)市萊陽中心醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 265200）

Array-CGH技術(shù)在產(chǎn)前診斷不平衡染色體改變中的應(yīng)用

宮玉典1劉文娟2

（1煙臺(tái)市心理康復(fù)醫(yī)院，山東 煙臺(tái)265200；2煙臺(tái)市萊陽中心醫(yī)院，山東 煙臺(tái) 265200）

Array-CGH技術(shù)；產(chǎn)前診斷；染色體不平衡；應(yīng)用

隨著全球污染的逐漸加重，越來越多的新生兒出生時(shí)帶有遺 傳基因缺陷。我國(guó)存在出生缺陷的新生兒人數(shù)占總出生人數(shù)的5%左右，近幾年出生缺陷發(fā)生率在逐年增加[1]。染色體不平衡畸變，其是導(dǎo)致人類先天性畸變最重要也是最常見的原因，其發(fā)病率占先天疾病發(fā)病率的20%左右[2]。Array-CGH的主要原理是將待測(cè)DNA與對(duì)照DNA使用不同熒光的生物素標(biāo)記，二者等量混合，使用足量的人Cot-1DNA抑制分散重復(fù)序列，將混合物雜交于微陣列芯片上，微陣列中包括全基因組DNA，當(dāng)待測(cè)DNA存在片段缺失時(shí)，對(duì)照DNA先與微陣列上的全基因組DNA結(jié)合，當(dāng)DNA存在片段擴(kuò)增時(shí)，待測(cè)DNA先與全基因組DNA結(jié)合，當(dāng)待測(cè)片段既不存在缺失也不存在擴(kuò)增，即DNA片段平衡時(shí)，對(duì)照DNA與待測(cè)DNA與全基因組DNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，收集結(jié)合的熒光信號(hào)，將熒光信號(hào)使用分析軟件處理[3]。對(duì)染色體不平衡的產(chǎn)前檢查可以有效降低出生缺陷率，改善妊娠結(jié)局，目前不平衡染色體的產(chǎn)前檢查手段主要有G顯帶核型分析，熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH），光譜核型分析技術(shù)（spectral karyotyping，SKY）等，但這些技術(shù)的檢出率低，漏查率高，本研究使用Array-CGH技術(shù)對(duì)不平衡染色體進(jìn)行產(chǎn)前檢查，期望尋找到準(zhǔn)確，有效，方便的不平衡染色體產(chǎn)前檢測(cè)技術(shù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2012年7月至2013年7月在我院行染色體檢查的18例產(chǎn)婦，其中染色體核型正常產(chǎn)婦4例，疑似染色體異常病例14例，其中G顯帶核型分析提示染色體異常但未檢測(cè)出染色體大片段不平衡畸變的病例8例，G顯帶核型分析未提示染色體微小片段不平衡畸變的病例6例。

1.2 方法

1.2.1 Array-CGH技術(shù)檢測(cè)

樣品準(zhǔn)備：提取病例外周血及羊水基因組DNA樣品，使用NSPⅠ限制性內(nèi)切酶消化2 h，使用T4 DNA連接酶連接接頭3 h。底物使用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s，60.0 ℃45 ℃，72 ℃ 1 min45s，35循環(huán)，72 ℃ 10 min。使用磁珠吸附法純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，使用末端轉(zhuǎn)移酶在提純的DNA產(chǎn)物末端標(biāo)記生物素，并將DNA變性。探針變性：將標(biāo)記的樣本加入雜交液混勻，變性10 min制成DNA探針。將探針加入芯片中50 ℃反應(yīng)24 h。洗滌和染色：將雜交后的芯片使用洗滌液清洗，并使用SAPE染色液進(jìn)行染色，之后加入生物素標(biāo)記的羊抗鏈酶親和素抗體與探針結(jié)合。結(jié)果分析：使用Genotyping Console及GCOS軟件進(jìn)行信號(hào)掃描與信號(hào)強(qiáng)度分析。

1.2.2 熒光原位雜交技術(shù)檢測(cè)驗(yàn)證

標(biāo)本制備：使用常規(guī)方法制備染色體標(biāo)本，室溫放置備用。標(biāo)本變性，將標(biāo)本放入65 ℃預(yù)熱的70%甲酰胺中2 min變性，將變性后的標(biāo)本放入70%、90%、100%的乙醇中進(jìn)行梯度脫水各2 min，之后將樣本取出，室溫放置晾干。探針變性：將生物素標(biāo)記的探針70 ℃水浴變性10 min，再使用水浴退火。雜交：將變性后的探針加于變性后的DNA樣本玻片之上，加蓋玻片進(jìn)行封片，將樣本置于37 ℃環(huán)境中過夜。洗滌：將樣本置于SSC液中5 min中，再使用50%甲酰胺洗滌2次，每次5 min，使用SSC液洗滌2次，每次5 min。將抗體加在樣本玻片上，37 ℃孵育20 min，使用SSC洗滌3次，每次5 min。在樣品玻片上加入DAPI封片液封片。結(jié)果檢測(cè)：使用熒光顯微鏡觀察樣本。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

本研究數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，使用方差分析（One-way ANOVA）分析各組組間差異，計(jì)數(shù)資料使用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較，均以P＜0.05作為具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 Array-CGH檢測(cè)結(jié)果

對(duì)25例患者進(jìn)行array-CGH分析，確診14例G顯帶核型分析未能明確診斷的染色體不平衡畸變，其中染色體微缺失6例，染色體大片段缺失2例，染色體片段重復(fù)3例，片段重復(fù)合并缺失的3例。

2.2 Array-CGH檢測(cè)結(jié)果與G顯帶核型分析檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

患者中有4例G顯帶核型分析未能明確診斷的染色體不平衡畸變。病例1：G顯帶核型結(jié)果為46，XY，r（11）（q9q34？），array-CGH結(jié)果為46，XY del（11）（q33.2-q34）。病例1 G顯帶結(jié)果未能明確染色體發(fā)生缺失時(shí)染色體的斷裂位點(diǎn)與缺失片段長(zhǎng)度，array-CGH結(jié)果顯示病例11號(hào)染色體的長(zhǎng)臂發(fā)生缺失，其位置為正常片段的105239475-117459863bp。病例2：G顯帶核型結(jié)果為46，XY，add（13）（q10？），array-CGH結(jié)果為46，XY dup（13q11.3-q21.3）。病例2 G顯帶結(jié)果未能明確染色體發(fā)生畸變的片段，array-CGH結(jié)果顯示病例13號(hào)染色體發(fā)生片段自身重復(fù)，其位置為正常片段的46825793-86359724bp。病例3：G顯帶核型結(jié)果為46，XY，add（11）（p11？），array-CGH結(jié)果為46，XY，dup（11）（p20.4-p10.4），del（11）（p21.6-p20.6）。病例3 G顯帶結(jié)果未能明確染色體發(fā)生不平衡畸變的模式，array-CGH結(jié)果顯示病例11號(hào)染色體發(fā)生重復(fù)合并缺失的染色體不平衡畸變，其中，重復(fù)片段位置為正常片段的21365947-36594219bp，缺失片段位置為正常片段位置69548271bp-78426921bp。病例4：G顯帶核型結(jié)果為46，XY，add（8）（q11？），pat，array-CGH結(jié)果為46，XY ，dup（8）（8q11-q21）。病例4 G顯帶結(jié)果未能明確染色體發(fā)生自身重復(fù)的位點(diǎn)與缺失片段長(zhǎng)度，array-CGH結(jié)果顯示病例8號(hào)染色體的長(zhǎng)臂發(fā)生自身重復(fù)，其位置為正常片段的26354985bp-59687125bp。

3 討 論

目前不平衡染色體的產(chǎn)前檢查手段主要有G顯帶核型分析，F(xiàn)ISH，SKY等，但這些技術(shù)存在缺陷，降低了不平衡染色體產(chǎn)前檢查的準(zhǔn)確性。如G顯帶核型分析對(duì)染色體微小片段結(jié)構(gòu)異常的分辨率差，如對(duì)5Mb以下的染色體結(jié)構(gòu)異常的檢出率為30%左右，漏診率可高達(dá)70%左右。FISH對(duì)染色體數(shù)目異常的檢測(cè)準(zhǔn)確度高，但對(duì)染色體結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè)準(zhǔn)確度低。SKY的不足之處是其無法顯示染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)異常的物理位置。本研究array-CGH結(jié)果不僅明確了患者發(fā)生染色體畸變的類型，還確定了染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生異常的具體位置。Array-CGH可對(duì)染色體結(jié)構(gòu)的異常做出明確診斷，為臨床預(yù)計(jì)妊娠結(jié)局，并做出相應(yīng)治療提供依據(jù)。

[1] Vialard F,Molina Gomes D,Leroy N,et al.Array comparative genomic hybridization in prenatal diagnosis:another experience[J].Fetal Diagn Ther,2009,25(2):277-284.

[2] Law L W,Lau TK,Fung TY,et al.De nove 16p13.11 microdeletion identified by high-resolution array CGH in a fetus with increased nuchal translucency[J].BJOG,2009,116(2):339-343.

[3] Kashork CD,Theisen A,Shaffer LG.Prenatal diagnosis using array CGH[J].Methods Mol Biol,2008,444(1):59-69.

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