乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞在皮膚形態(tài)發(fā)生和內(nèi)穩(wěn)態(tài)中彼此獨(dú)特且互補(bǔ)的作用

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乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞在皮膚形態(tài)發(fā)生和內(nèi)穩(wěn)態(tài)中彼此獨(dú)特且互補(bǔ)的作用

真皮層是人類(lèi)皮膚的重要組成部分，位于由多層角質(zhì)形成細(xì)胞組成的表皮與皮下組織之間。真皮與表皮通過(guò)基底膜帶(BMZ)既被相互分隔又有密切的聯(lián)系。目前研究認(rèn)為，真皮可分為兩個(gè)不同的部分，分別為表淺部的乳頭層和深部的網(wǎng)狀層。這兩層的組成和結(jié)構(gòu)在細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞密度和存在的神經(jīng)及血管結(jié)構(gòu)等方面有明顯不同。Ⅲ型膠原主要存在于真皮乳頭層，而Ⅰ型膠原則二層均可見(jiàn)，Ⅰ型前膠原優(yōu)先產(chǎn)生于靠近表皮的乳頭層。核心蛋白聚糖和雙鏈蛋白聚糖(蛋白聚糖家族)也優(yōu)先表達(dá)于乳頭層，網(wǎng)狀層內(nèi)幾乎不表達(dá)。真皮結(jié)構(gòu)蛋白(如肌腱蛋白亞型)在真皮內(nèi)也具有明確的分布特點(diǎn)，肌腱蛋白C分布于乳頭層，肌腱蛋白X分布于網(wǎng)狀層。成纖維細(xì)胞是真皮主要的細(xì)胞類(lèi)型。成纖維細(xì)胞產(chǎn)生ECM的成分并對(duì)其進(jìn)行組織，且通過(guò)稱(chēng)為整合素的膜受體與ECM相互作用。成纖維細(xì)胞還通過(guò)分泌分子和可溶性因子參與皮膚生理學(xué)功能的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及其基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)。

近年來(lái)，已證實(shí)真皮成纖維細(xì)胞并非同一群細(xì)胞，至少可被分為兩種亞群。乳頭層成纖維細(xì)胞(papillary fibroblasts，F(xiàn)p)，聚集于真皮表淺部、表皮下方，由表皮真皮連接部(DEJ)將其與表皮隔開(kāi)；網(wǎng)狀層纖維細(xì)胞(reticular fibroblasts，F(xiàn)r)位于其余真皮部分。有文獻(xiàn)報(bào)道，這兩種類(lèi)型的真皮成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)特性不同，如細(xì)胞形態(tài)和增殖速率。研究還證實(shí)，F(xiàn)p的生物學(xué)特性會(huì)隨年齡增長(zhǎng)而改變，老年人皮膚內(nèi)的Fp數(shù)量明顯減少。乳頭層成纖維細(xì)胞的密度高于網(wǎng)狀層內(nèi)的成纖維細(xì)胞，且其代謝活性更強(qiáng)。體外培養(yǎng)時(shí)，從真皮乳頭層和網(wǎng)狀層分離的成纖維細(xì)胞顯示出不同的特性。Fp比Fr的生長(zhǎng)能力強(qiáng)；相比Fp的細(xì)胞形態(tài)，F(xiàn)r則更多表現(xiàn)為樹(shù)突狀和伸展?fàn)?。此外，F(xiàn)r比Fp的細(xì)胞匯合密度低，且接觸抑制敏感性較高。

在單層培養(yǎng)物中，兩種成纖維細(xì)胞亞群均能合成細(xì)胞外基質(zhì)大分子，但合成的種類(lèi)和數(shù)量不同。例如，F(xiàn)r產(chǎn)生的Ⅰ型膠原和多功能蛋白聚糖多于Fp；而Fp產(chǎn)生的核心蛋白聚糖多于Fr。兩種細(xì)胞亞群產(chǎn)生的細(xì)胞因子和激素也均有不同。例如，F(xiàn)p合成的GM-CSF多于Fr；相反，F(xiàn)r產(chǎn)生的KGF多于Fp?？傊?，這些結(jié)果證實(shí)，培養(yǎng)的真皮乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞其特性有差異。然而，尚無(wú)研究顯示這兩種亞群對(duì)人皮膚形態(tài)發(fā)生(重建)的影響。該研究的目的是調(diào)查這兩種真皮成纖維細(xì)胞亞群在人體外重建皮膚(其結(jié)構(gòu)接近于在體皮膚)形態(tài)發(fā)生中所起的作用。為此，該研究使用了人體外重建皮膚3D模型，其真皮由Fp或Fr成纖維細(xì)胞填充。該研究顯示，皮膚真皮乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞的作用既有差異，又互為補(bǔ)充，提示二者對(duì)人皮膚的正常形態(tài)發(fā)生和內(nèi)穩(wěn)態(tài)都是必需的。

一、材料和方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞來(lái)源于3名19～21歲的年輕白種人捐贈(zèng)的乳房皮膚。使用皮刀分離真皮乳頭層和網(wǎng)狀層。將切片置于培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)分離伸展開(kāi)的乳頭層或網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞。將乳頭層或網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞平鋪在150 cm2的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，密度為1×104細(xì)胞/cm2。成纖維細(xì)胞在添加了非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素-鏈霉素(20 U/ml)和10%胎牛血清的MEM(minimum essential Eagle's medium)內(nèi)生長(zhǎng)。培養(yǎng)物保存于37℃、95%濕度和5%CO2環(huán)境下。每周更新3次培養(yǎng)基，直至成纖維細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)入亞匯合狀態(tài)。該研究的角質(zhì)形成細(xì)胞來(lái)源于1名30歲白種人捐贈(zèng)的乳房皮膚。

2.人體外重建皮膚：使用包埋于牛Ⅰ型膠原凝膠內(nèi)的人真皮乳頭層或網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞(每個(gè)培養(yǎng)格1×106個(gè)成纖維細(xì)胞)制備真皮替代物(膠原成纖維細(xì)胞收縮格)。終體積為7 ml(含培養(yǎng)基)，包括2 ml的膠原(濃度為3.5 mg/ml)。培養(yǎng)格在37℃和5%CO2環(huán)境下可以收縮5 d。使用不銹鋼圈將人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞種植在真皮替代物上，進(jìn)行表皮重建。將培養(yǎng)物浸沒(méi)培養(yǎng)1周，然后提至氣液交界處的網(wǎng)格上1周，以產(chǎn)生分層和分化的表皮。使用添加10%胎牛血清、10 ng/ml表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、8.4 ng/ml霍亂毒素和0.4 μg/ml氫化可的松的MEM，培養(yǎng)基每周更新3次。

3.組織學(xué)處理：樣本被固定在中性甲醛內(nèi)，進(jìn)行組織學(xué)處理。用蘇木精、伊紅、藏紅花(HES)染色石蠟切片。

4.免疫組織化學(xué)：樣本包埋在Tissue-Tek內(nèi)，切成5 μm的切片液氮凍存。小鼠單克隆抗體抗：人絲聚蛋白、角蛋白10、原纖蛋白1；大鼠單克隆抗體抗人Ⅰ型前膠原；兔多克隆抗體抗人Ⅲ型前膠原；兔多克隆抗血清抗人兜甲蛋白；小鼠單克隆上清液(蛋白聚糖抗體)抗人皮膚素和抗硫酸軟骨素鏈。異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合的兔抗小鼠免疫球蛋白，或Alexa結(jié)合的山羊抗小鼠免疫球蛋白，或FITC結(jié)合的山羊抗大鼠免疫球蛋白，或FITC結(jié)合的豬抗兔免疫球蛋白被用作二抗。使用普羅匹定碘化物進(jìn)行核染色。在熒光顯微鏡下觀察并成像染色的組織切片。

5.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定MMP1、MMP3、VEGF和KGF：使用ELISA試驗(yàn)測(cè)定組織培養(yǎng)基內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP1)、間質(zhì)膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP3)、基質(zhì)降解酶、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的含量。

6.酶譜分析：用NOVEX預(yù)制酶譜凝膠通過(guò)檢測(cè)蛋白水解活性來(lái)研究金屬蛋白酶。具體方法參見(jiàn)原文。

7.對(duì)樣本進(jìn)行RT-PCR、逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR的分析：具體方法參見(jiàn)原文。

二、結(jié)果

1.人真皮的兩層結(jié)構(gòu)分別含有兩種不同的成纖維細(xì)胞亞群：人皮膚的外部為分層的表皮(E)，其下方相對(duì)較薄的一層真皮結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)為真皮乳頭層(DP)，而較厚的深部層對(duì)應(yīng)為真皮網(wǎng)狀層(DR)。組織學(xué)研究顯示，角質(zhì)層由表皮內(nèi)角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生，并證實(shí)真皮乳頭層與網(wǎng)狀層的基質(zhì)結(jié)構(gòu)有顯著差異。

2.體外培養(yǎng)的乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞的增殖速率和膠原收縮：比較短期培養(yǎng)物中Fp和Fr各自的生長(zhǎng)率。Fp的生長(zhǎng)率明顯高于Fr。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(23d)，F(xiàn)p的數(shù)量是Fr的兩倍。單層培養(yǎng)物組織學(xué)結(jié)果顯示，二者細(xì)胞形態(tài)有差異。4 d后評(píng)估Fp和Fr的膠原凝膠收縮能力。凝膠的收縮在Fr存在時(shí)更為明顯，尤其是在初始收縮期(第1個(gè)24 h)。

3.真皮乳頭層成纖維細(xì)胞的存在促進(jìn)表皮的最佳分化：表皮分化的連續(xù)性形態(tài)學(xué)變化與角質(zhì)形成細(xì)胞的主要基因產(chǎn)物的表達(dá)有關(guān)，如角蛋白和中間絲相關(guān)蛋白等。角質(zhì)形成細(xì)胞分化的4個(gè)階段與表皮各層相對(duì)應(yīng)：基底層、棘細(xì)胞層、顆粒層和角質(zhì)層。角蛋白10的免疫組織學(xué)染色證實(shí)了兩種成纖維細(xì)胞亞群均能維持表皮的形態(tài)發(fā)生。角蛋白是角質(zhì)形成細(xì)胞分化標(biāo)記物之一，在Fp和Fr存在時(shí)大量表達(dá)。比較用Fp或Fr構(gòu)建的人體外重建皮膚的組織學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)皮膚模型的表皮層存在著明顯差異。Fp存在時(shí)，表皮分層和分化表現(xiàn)最佳；反之，F(xiàn)r存在時(shí)，表皮結(jié)構(gòu)化程度較低，顆粒層缺乏。中間絲蛋白和兜甲蛋白的免疫染色可證明顆粒層的分化水平，兩種標(biāo)記物在Fp存在的條件下均可大量表達(dá)，而Fr存在時(shí)表達(dá)較低。RT PCR的定量分析也在mRNA水平上證實(shí)了這些結(jié)果。結(jié)果清楚地顯示，F(xiàn)p細(xì)胞具有較高的促終末角質(zhì)形成細(xì)胞分化能力，能夠在體外重建皮膚模型內(nèi)促進(jìn)結(jié)構(gòu)良好的表皮形態(tài)發(fā)生。

4.真皮網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞的存在有效促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生：在真皮內(nèi)，由真皮成纖維細(xì)胞產(chǎn)生和組織的細(xì)胞外基質(zhì)分子非常重要。真皮細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和DEJ成分在含有Fr的體外重建皮膚模型內(nèi)含量較高。Fr存在時(shí)，真皮的成熟和真表皮連接部基底膜更明顯。免疫組織化學(xué)和mRNA結(jié)果證實(shí)，在含有Fr的體外重建皮膚模型中，Ⅰ型和Ⅲ型前膠原及糖胺聚糖鏈的沉積明顯較高。這些結(jié)果證實(shí)，在體外重建皮膚模型中，相比Fp，網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞有效參與主要細(xì)胞外基質(zhì)分子如Ⅰ型和Ⅲ型膠原、蛋白聚糖(PG4)和原纖蛋白1的生成。

5.乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞釋放MMPs和生長(zhǎng)因子的相對(duì)特異性：如MMPs、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子等在細(xì)胞外環(huán)境中的釋放能夠維持皮膚的正常生理功能。使用ELISA或酶譜法分析分別由Fp和Fr構(gòu)建的體外重建皮膚模型培養(yǎng)基內(nèi)的可溶性因子。MMPs對(duì)真皮基質(zhì)的降解起重要作用，并與其重構(gòu)有關(guān)。Fp能夠上調(diào)MMP1，而Fr能刺激MMP3的產(chǎn)生。含有Fp的重建皮膚培養(yǎng)基中的MMP1水平(mRNA和蛋白)是含F(xiàn)r的2至3倍。MMP3的結(jié)果則完全相反。與Fp相比，F(xiàn)r存在時(shí) MMP2活性(酶譜分析)和mRNA MMP2表達(dá)水平較高。

分別檢測(cè)含有Fp和Fr的體外重建皮膚培養(yǎng)基中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)。結(jié)果顯示，含有Fp時(shí)，VEGF量是含有Fr的兩倍。與此相反，與Fp相比，含有Fr時(shí)KGF呈雙倍增長(zhǎng)。

三、討論

體外重建皮膚模型的使用可以更加詳細(xì)地研究成纖維細(xì)胞在皮膚形態(tài)發(fā)生中的作用，因?yàn)榇四Ｐ湍軌蚪閷?dǎo)真皮成分中的既定成纖維細(xì)胞亞群而構(gòu)成。該研究比較了乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞制備的兩種體外重建皮膚模型。使用新鮮分離的Fr和Fp，首次證實(shí)了乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞在生長(zhǎng)速率和膠原格收縮能力方面存在的差異，這是一個(gè)重要的先決條件。使用體外重建皮膚模型，將這些細(xì)胞類(lèi)型放置在接近在體真實(shí)皮膚的3D環(huán)境中并加以比較，可以對(duì)其差異進(jìn)行更進(jìn)一步地研究。

研究結(jié)果顯示，乳頭層成纖維細(xì)胞，通過(guò)與表皮角質(zhì)形成細(xì)胞相互“交流”，極好地促進(jìn)了表皮的分層和終末分化，這或許如實(shí)地反映了在體相互作用的過(guò)程。該研究還顯示，F(xiàn)p具有較高的VEGF生成刺激能力，但是缺乏預(yù)期的產(chǎn)生真皮和DEJ的主要細(xì)胞外基質(zhì)分子成分的功能，可能與網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞的缺乏以及作為輔助因子對(duì)乳頭層成纖維細(xì)胞的潛在影響相關(guān)。雖然Fp緊挨著表皮的DEJ，但該研究結(jié)果顯示，在現(xiàn)有的體外重建皮膚模型實(shí)驗(yàn)條件下，與Fr的相互作用似乎是DEJ形成所必不可少的條件。

該研究還顯示，在體內(nèi)環(huán)境中活性較弱的網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞在真皮細(xì)胞外基質(zhì)成分及DEJ細(xì)胞外基質(zhì)分子的生成上具有意想不到的活性。這或許是因?yàn)閷⑵渲糜谌轭^層環(huán)境中，與表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的異常接近所致。網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞對(duì)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的影響也可以通過(guò)創(chuàng)傷愈合過(guò)程中特征性KGF的釋放加以說(shuō)明，很可能是所觀察到的表皮終末分化受到輕微抑制的原因。KGF可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，但會(huì)抑制其終末分化能力。KGF在Fr存在時(shí)高表達(dá)，可以解釋在用Fr構(gòu)建的模型中所發(fā)現(xiàn)的角質(zhì)形成細(xì)胞分化延遲和基底層角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)量相對(duì)增加的觀察結(jié)果。Fp與Fr的功能性差異對(duì)人皮膚老化也具有重要意義，特別是真皮Fp亞群隨年齡的增長(zhǎng)而逐漸消失。這種可能性很重要，因?yàn)槿轭^層成纖維細(xì)胞被網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞所替代可以導(dǎo)致KGF增加，進(jìn)而造成表皮分層和分化的損傷。

總之，該研究結(jié)果證實(shí)，乳頭層和網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞具有獨(dú)特且互補(bǔ)的作用。為了檢驗(yàn)體外皮膚全層模型，今后的研究需進(jìn)一步發(fā)展至使用乳頭層成纖維細(xì)胞和網(wǎng)狀層成纖維細(xì)胞兩種亞細(xì)胞群組成的真皮替代物來(lái)重建皮膚模型，使得體外重建皮膚更接近在體皮膚細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。

[陳旭 孔佩慧 甄雅賢 摘自 Eur J Dermatol，2012，22(3):324-332.]