人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)及向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究

林增平 鐘繼平 聶達(dá)榮

1 材料與方法

1.1 材料 ①DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)原裝進(jìn)口100%胎牛血清、0.25%胰酶-0.02%EDTA細(xì)胞消化液(美國GIBCO公司)。②正轉(zhuǎn)化生長因子β-1(TGF-β1)、生長因子［IGF-I(美國Peprotech公司)］。③1.075 g/ml人淋巴細(xì)胞分離液(津脈基因測繪技術(shù)有限公司)。④Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒(Boster)。⑤FICT標(biāo)記鼠抗人CD44、CD45單克隆抗體(晶美生物)。

1.2 方法

1.2.1 取材 人骨髓10 ml, DMEM/F12稀釋1倍, 與人淋巴細(xì)胞分離液1：2混合, 密度梯度離心(2000 r/min)10 min, 吸取中間層的單核細(xì)胞(呈云霧狀), 再離心(2000 r/min)5 min。使用完全培養(yǎng)液將沉淀物制成密度為1×105/ml的懸浮液。吸取6 ml該細(xì)胞懸浮液, 置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每3天換液1次,鏡下觀細(xì)胞達(dá)90%～95%左右融合時(shí), 用細(xì)胞消化液消化, 1：3傳代, 傳代培養(yǎng)時(shí), 細(xì)胞的密度為8×103/cm2較為適宜(注：完全培養(yǎng)液：DMEM/F12中含10%的胎牛血清(FBS)+維生素C 0.05 g/L+青霉素10 U/L+鏈霉素0.1 g/L。細(xì)胞消化液：0.25%胰酶+0.02%EDTA)。

1.2.2 BMSCs的鑒定［1］取3 ml第3代細(xì)胞密度為5×105/ml與5 μlFICT標(biāo)記的鼠抗人一抗混合, 待兩者充分結(jié)合后,緩沖液洗2次后制成懸浮液, 使用流式細(xì)胞儀檢測CD44、CD45抗原表達(dá)情況。

1.2.3 取第3代人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞懸浮液置于培養(yǎng)板中,該培養(yǎng)板底部放置一蓋玻片, 置入的細(xì)胞密度為8×103/cm2,放入培養(yǎng)箱3 d 后改為軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)14 d, 再將上述蓋玻片行甲苯胺藍(lán)染色、HE染色及Ⅱ型膠原免疫組化,設(shè)完全培養(yǎng)液組為陰性對照, 緩沖液代替Ⅱ型膠原為空白對照。(注：軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)液：DMEM/F12中含5%的FBS, 6.25 ng/ml的TGF-β1, 50 ng/ml的IGF-I, 地塞米松40 ng/ml, 維生素C 0.05 g/L, 青霉素10 U/L, 鏈霉素0.1 g/L)。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng) 24 h后細(xì)胞開始貼壁, 剛貼壁的細(xì)胞呈圓形, 隨后逐漸伸出偽足, 以短小梭形為主, 細(xì)胞呈集落樣分布, 集落區(qū)數(shù)目不一, 一個(gè)集落區(qū)內(nèi)細(xì)胞數(shù)目也不一。3 d后首次換液, 大量懸浮細(xì)胞去處(主要是紅細(xì)胞), 鏡下可見短小梭形細(xì)胞較前增多, 但排列無方向性。隨換液時(shí)間延長,細(xì)胞形態(tài)逐漸趨向一致, 以中等梭形為主。第11天細(xì)胞已達(dá)80～90%左右融合, 此時(shí)細(xì)胞增殖速度較前減慢。傳代后細(xì)胞增殖明顯加快。形態(tài)較均一, 呈中等梭形, 排列有方向性, 旋渦樣、同心圓樣分布。第6天細(xì)胞已達(dá)95%以上融合。第8代后細(xì)胞生長減慢, 形態(tài)不規(guī)則, 排列失去方向性, 胞內(nèi)黑色顆粒增多, 折光性能差, 開始出現(xiàn)老化。

2.2 細(xì)胞表型鑒定 單參數(shù)流式細(xì)胞儀檢測CD44陽性率為88.6%, 其陰性對照組為0.84%。CD45陽性率為0.73%, 其陰性對照組為0.82%。

2.3 BMSCs的定向分化 HE染色可見細(xì)胞呈梭形, 核為橢圓形, 核仁2～4個(gè)不等。甲苯胺蘭染色誘導(dǎo)組細(xì)胞外基質(zhì)出現(xiàn)紫紅色異染, 對照組及空白組未被染色。Ⅱ型膠原免疫組化誘導(dǎo)組可見胞漿染成棕黃色, 局部為深黃色, 陰性對照組及空白組未見有棕黃色。

3 討論

軟骨缺損或損傷是常見的疑難病癥之一。軟骨細(xì)胞幾乎沒有遷徙能力, 增生能力差, 再生能力低, 因此軟骨缺損或損傷后難以自體修復(fù)。而且自體或異體移植成形的軟骨因其生物性能、耐磨性、韌性均欠佳, 易蛻變。由于軟骨細(xì)胞取材難、來源有限, 同時(shí)體外培養(yǎng)時(shí)易去分化, 因此不適合作為種子細(xì)胞。然而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有來源充足, 取材容易, 能夠自我更新增殖, 而且還具有向骨、軟骨、脂肪等多向分化潛能, 已成為組織工程中的理想種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)抽取成人骨髓, 消除了種屬間不相容的弊端, 更適合于臨床應(yīng)用。由于BMSCs表面缺乏特異性特征, 目前其鑒定重要通過陰性選擇及陽性選擇相結(jié)合。本實(shí)驗(yàn)選擇生長良好的第3代細(xì)胞, 使用流式細(xì)胞儀, 結(jié)果顯示 CD44陽性率為88.6%,CD45陽性率為0.73%, 研究表明CD44是BMSCs重要抗原標(biāo)記之一, 而CD45是造血干細(xì)胞抗原標(biāo)記, BMSCs不表達(dá)CD45, 因此結(jié)果顯示所取的第3代細(xì)胞為純度較高的BMSCs,其中還含有少量的造血干細(xì)胞以及極少量的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞。同時(shí)也表明采用貼壁培養(yǎng)與密度梯度離心法相結(jié)合,能夠分離到純度較高的BMSCs。而且所獲得的BMSCs具有自我更新增殖的能力, 但7代后細(xì)胞開始出現(xiàn)增殖速度變慢,第8代時(shí)更明顯, 且部分細(xì)胞失去原有的梭形狀, 變的寬大扁平, 折光性下降, 出現(xiàn)老化現(xiàn)象, 因此BMSCs并不具有無限自我更新增殖的能力。

研究表明軟骨細(xì)胞代謝物質(zhì)有助于BMSCs向軟骨細(xì)胞分化, 而軟骨細(xì)胞能分泌較多的TGF-β1、IGF-I等, 因此TGF-β1、IGF-I均有助于BMSCs向軟骨細(xì)胞分化［2］。在一定的條件下, TGF-β1的溶度范圍與BMSCs的轉(zhuǎn)化率呈劑量-效應(yīng)關(guān)系, 有研究表明5～10 μg/L TGF-β1能提高BMSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化率, 且能刺激BMSCs分泌Ⅱ型膠原和蛋白聚糖。有研究發(fā)現(xiàn)使用10 μg/L TGF-β1不僅有助于BMSCs向軟骨細(xì)胞分化, 而且還能維持軟骨細(xì)胞表型。TGF-β1與IGF-I在促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化過程中具有協(xié)同效應(yīng),IGF-I可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的有絲分裂和細(xì)胞外基質(zhì)的Ⅱ型膠原及蛋白聚糖的合成, 但對于IGF-I與BMSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的劑量-效應(yīng)關(guān)系研究尚少, 本實(shí)驗(yàn)在含有5%的胎牛血清中, 將6.25 ng/ml TGF-β1與50 ng/ml IGF-I聯(lián)合應(yīng)用, 經(jīng)軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)后, 通過測定蛋白聚糖和Ⅱ型膠原分泌情況而證實(shí)BMSCs是否向軟骨細(xì)胞分化, 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí), BMSCs經(jīng)誘導(dǎo)后分泌了具有軟骨細(xì)胞特性的基質(zhì)-蛋白聚糖和Ⅱ型膠原, 本實(shí)驗(yàn)條件能夠使BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。但對于TGF-β1、IGF-I、BMSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化率三者之間的劑量-效應(yīng)關(guān)系, 還需進(jìn)一步研究, 同時(shí)本實(shí)驗(yàn)未見明顯的軟骨陷窩及同源細(xì)胞群, 因此尋找更適合于BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的條件也還需進(jìn)一步研究。

［1］Sakai D, Mochida J, Iwashina T, et al.Regenerative effects of transplanting mesenchymal stem cells embedded in atelocollagen to the degenerated intervertebral disc.Biomaterials, 2006, 27(3):335-345.

［2］裴國獻(xiàn), 金丹.骨組織工程研究進(jìn)展.中華創(chuàng)傷骨科雜志,2004, 6(1):38-42.