腫瘤壞死因子α在超重者脂肪組織中的表達

何衡杰 郝 麗

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽合肥 230601

近年來許多研究證實了腫瘤壞死因子與胰島素抵抗有關(guān)，且肥胖者脂肪分泌的腫瘤壞死因子可能是正常者的數(shù)倍。但對于為數(shù)眾多的超重者，相關(guān)文獻相對較少。本實驗旨在觀察是否超重者脂肪組織也存在TNF-α基因表達增強，正常及超重者腹部皮下脂肪組織及網(wǎng)膜脂肪組織的TNF-α基因表達有無差異。

1 對象與方法

1.1 研究對象

均為在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科做手術(shù)的安徽漢族人，排除了感染、肝臟疾病及其他內(nèi)分泌代謝疾病等。實驗的分類標(biāo)準(zhǔn)為《中國成人超重與肥胖癥預(yù)防與控制指南》，2003年該指南由中國肥胖問題工作組編寫，超重組19人，BMI在24～28 kg/m2之間，年齡為22～75歲，平均年齡 48.9歲;正常組 24人,BMI在18.5～24 kg/m2之間,年齡為 33～70歲，平均年齡為51.2歲；二組年齡及性別基本匹配。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)時取腹部皮下、網(wǎng)膜脂肪組織，取樣后用液氮迅速冷凍并低溫保存。按QIAGEN公司提供RNeasy Mini Kit試劑盒說明書要求提取脂肪組織總RNA。紫外分光光度儀測定及瓊脂糖電泳判斷RNA質(zhì)量。根據(jù)基因特異性cDNA序列，通過軟件primer 5.0設(shè)計特異性擴增引物，擴增TNF-α基因的特異性引物，上游序列為：5ˊ-GTGACAAGCCTGTAGCCCAT-3ˊ，下游序列為：5ˊ-TAGATGGGCTCATACCAGGG-3ˊ，擴增片段長度331bp；擴增β-actin基因的引物，上游序列為：5ˊ-GCTATCCAGGCTGTGCTATC-3ˊ，下游序列為：5ˊ-CAGCACTGTGTTGGCGTACA-3ˊ，擴增片段長度495 bp。RT-PCR：總RNA2 uL，5倍逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4 uL,Oligo(dT)18 2.5 uL,RNA酶抑制劑0.5 uL,逆轉(zhuǎn)錄酶AMV 2 uL,dNTP 8 uL,加DEPC處理水至 20 uL,28℃放置 10 min，42℃溫育2 h，99℃5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)體系中包括：模板10 uL，10倍PCR反應(yīng)緩沖液5 uL，4種混合單核苷酸4 uL，腫瘤壞死因子上下游引物及β-actin上下游引物各1.0 uL,Taq酶0.7uL,加DEPC處理水至反應(yīng)總體積50 uL。第一步：94℃預(yù)變性1 min；第二步：30個循環(huán)即 94℃變性 32s，59.9℃退火 40s，72℃延伸 1 min；第三步：72℃再延伸4 min[1]。1.2%的瓊脂糖凝膠電泳反應(yīng)產(chǎn)物，通過凝膠成像分析系統(tǒng)來測定每個單獨條帶的亮度，并在此基礎(chǔ)上計算出條帶的光密度比值（TNF-α/β-actin），見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

0:分子量標(biāo)準(zhǔn)DL 2,000;1-4:腹部皮下及網(wǎng)膜脂肪組織中TNF-α和β-actin基因PCR產(chǎn)物。

1.2.2 測身高、體重，腰圍（腰圍測量是以腋中線肋下緣與髂骨上緣間中點水平周長）、臀圍（臀圍為以恥骨聯(lián)合水平測量臀部的最大周長），并在以上的基礎(chǔ)上計算腰臀比例和體重指數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比較采用t檢驗，相關(guān)因素采用線性相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組光密度比值之間的兩兩比較

TNF-α基因在超重組的皮下脂肪組織表達變化較正常組略有增強，但差異無顯著性(P＞0.05)；TNF-α基因在網(wǎng)膜脂肪組織的表達變化比正常組也略有增強，差異無顯著性(P＞0.05)；所以說，在超重組和正常組中，皮下與網(wǎng)膜的基因TNF-α表達變化的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 TNF-α基因在皮下與網(wǎng)膜的表達與各指標(biāo)的雙變量相關(guān)性分析

皮下的 TNF-α 基因表達與 WC（γ=0.420,P＜0.05）、WHR（γ=0.416,P＜0.05）成正相關(guān);網(wǎng)膜的 TNF-α 基因表達與 WC（γ=0.360,P＜0.05）、WHR(γ=0.368,P＜0.05)成正相關(guān)；BMI、AGE 與兩種組織的TNF-α基因表達沒有相關(guān)性（見表1）。

表1 皮下與網(wǎng)膜的TNF-α基因表達與各指標(biāo)的雙變量相關(guān)分析

3 討論

脂肪組織的細(xì)胞在發(fā)生腫瘤時會表達和釋放一種產(chǎn)物叫腫瘤壞死因子，其中TNF-α基因可能存在兩種分泌途徑，即旁分泌和自分泌，從而刺激脂肪細(xì)胞發(fā)生分解消失，另外會通過減少LPL的生成并減弱其活性，從而生成脂肪細(xì)胞的能力變?nèi)?，還會通過干擾誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞的分化和刺激成熟脂肪細(xì)胞逆分化兩種方式來阻擾脂肪細(xì)胞發(fā)生分化，從而使得前脂肪細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的凋亡速度加快，最終防止擴大了脂肪組織的整個體積[2-3]。

近年來，有一些關(guān)于TNF-α基因表達與肥胖和超重的研究。首先，前人發(fā)現(xiàn)在肥胖組的脂肪組織中TNF-α基因表達量有所增加，而隨著體重的減輕，基因TNF-α表達量隨之減少[4]。然而在對人類的研究上發(fā)現(xiàn)分歧：BMI為體重指數(shù)，其中BMI＞30kg/m2為超重組，BMI＜25 kg/m2為正常組，對兩組對比發(fā)現(xiàn)，超重組的皮下和細(xì)胞中TNF-a基因會過度表達，約為對照組中TNF-a基因表達的2.5倍[5]，Bullo等對96例婦女的研究表明，TNF-α基因表達與脂肪容量成比例關(guān)系[6]；但也有不同的結(jié)果，前人對39位體重指數(shù)各異的人為研究對象，結(jié)論是BMI與脂肪組織中TNF-α基因表達變化呈現(xiàn)出正相關(guān)只限于體重指數(shù)介于27～45kg/m2者，高度肥胖者則不在此列[7]；得出相反的結(jié)論是Koistinen和李曉男等的研究，顯示消瘦和肥胖者皮下脂肪組織的TNF-α基因基因表達基本無差異[8-9]，本實驗通過對19例超重者和24例對照者的研究顯示超重組皮下脂肪組織TNF-α基因表達比正常體重組略有增強，沒有統(tǒng)計學(xué)意義，與前人結(jié)果相符。但是還存在不同的研究結(jié)果，Montague等通過試驗發(fā)現(xiàn)人體腹部的皮下和網(wǎng)膜的TNF-α基因表達是一致的[10]；本實驗中網(wǎng)膜的TNF-α基因表達較正常組也略有增強，但同樣無顯著性差異；超重組與正常組的皮下與網(wǎng)膜之間的TNF-α基因表達比較發(fā)現(xiàn)，P值均大于0.05，差異不顯著，與Montague等的結(jié)果相符。兩組合并后相關(guān)分析顯示W(wǎng)C、WHR與在皮下及網(wǎng)膜中表達基因TNF-α的變化相關(guān)性為正向的，與BMI、AGE與此基因無相關(guān)性。提示兩種脂肪組織TNF-α基因表達隨中心性肥胖體型的趨勢而上升，并且和體重指數(shù)具有密切的關(guān)系。

本實驗通過對超重者19例和對照者24例的比較研究顯示：超重組皮下及網(wǎng)膜脂肪組織的TNF-α基因表達無明顯增強，無論是超重組還是正常組，皮下與網(wǎng)膜之間的TNF-α基因表達比較，不存在統(tǒng)計學(xué)意義。

[1]胡國平，劉鈴，王佑民,等.肥胖癥患者皮下和網(wǎng)膜脂肪組織中PPARγ2的表達與血漿瘦素、腫瘤壞死因子α和游離脂肪酸的關(guān)系[J].安徽醫(yī)學(xué)，2005（4）:257-260.

[2]孫暉.生活方式干預(yù)對胰島素抵抗大鼠脂肪組織腫瘤壞死因子α及其受體表達的影響[D].華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2007.

[3]曹艷麗.脂肪組織中腫瘤壞死因子-α與血漿纖溶酶原激活抑制物-1相關(guān)性的研究[D].安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008.

[4]鄭娜.4-羥基異亮氨酸抑制TNF-α表達改善胰島素抵抗[D].華中科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013.

[5]Rupert Oberauer,Wolfgang Rist,Martin C.Lenter，et al.EGFL6 is increasingly expressed in human obesity and promotes proliferation of adipose tissue-derived stromal vascular cells[J].Molecular and Cellular Biochemistry,2010（343）:257-269

[6]Bullo M，Garcia-Lorda P，Peinado-Onsarbe J，et al.TNF alpha expression of subcutaneous adipose tissue in obese and morbid obese females:relationship to adipocyte LPL activity and leptin synthesis[J].Int J Obes Relat Metab Disord，2002,26(5):625-628.

[7]何衡杰.腫瘤壞死因子α在超重者脂肪組織中的表達[D].安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005.

[8]Koistinen HA,Bastard JP,Dusserre E，et al.Subcutaneous adipose tissue expression of tumour necrosis factor-alpha is not associated with who insulin resistance in obese nondiabetic or in type-2 diabetic subjects[J].Eur J Clin Invest，2000，30(4):302-310.

[9]李曉南，陳榮華，Tommy Olsson，et al.人類皮下和網(wǎng)膜脂肪組織脂肪細(xì)胞因子的表達[J].江蘇醫(yī)藥，2005（12）：914-916，880.

[10]Montague CT,Prins JB,Sanders L,et al.Depot-related gene expression in human subcutaneous and omental adipocytes[J].Diabetes,199 （47）:1384-1391.