精原干細(xì)胞研究進(jìn)展

宋瑞高，姚曉磊，石 磊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801）

綜述與專論

精原干細(xì)胞研究進(jìn)展

宋瑞高，姚曉磊，石 磊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 030801）

精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是各種雄性動(dòng)物生殖細(xì)胞的母細(xì)胞，是一群具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞，并且在雄性個(gè)體中精原干細(xì)胞與下一代的遺傳背景密切相關(guān)。因此，精原干細(xì)胞在細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、轉(zhuǎn)基因等領(lǐng)域的研究有著廣闊的應(yīng)用前景。文章根據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)展，對(duì)精原干細(xì)胞的生物學(xué)特性、分離純化與培養(yǎng)、移植等作一概述。

精原干細(xì)胞；生物學(xué)特性；分離純化；移植

哺乳動(dòng)物雄性成體中的精子發(fā)生系統(tǒng)在雄性配子的產(chǎn)生和進(jìn)化過(guò)程中起著基因傳遞的作用，這一系統(tǒng)的基礎(chǔ)就是精原干細(xì)胞（spermatogonial stemcells，SSCs）。精原干細(xì)胞位于曲精細(xì)管基膜上，其即能自我更新產(chǎn)生新的細(xì)胞，也能通過(guò)基因或者外來(lái)信號(hào)的調(diào)節(jié)進(jìn)行自我分化，最終產(chǎn)生精細(xì)胞，是雄性成體內(nèi)唯一可復(fù)制的二倍體的永生細(xì)胞，也是成年哺乳動(dòng)物體內(nèi)唯一能將遺傳信息傳遞給下一代的成體干細(xì)胞［1］。近幾年來(lái)精原干細(xì)胞移植技術(shù)、體外培養(yǎng)技術(shù)及凍存技術(shù)等新技術(shù)的使用，使得精原干細(xì)胞的應(yīng)用成為可能，對(duì)于了解精子的發(fā)生和調(diào)控機(jī)制、不孕癥的治療、建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型有重要意義?，F(xiàn)對(duì)精原干細(xì)胞的生物學(xué)特性、分離純化與培養(yǎng)、移植作一簡(jiǎn)要綜述。

1 精原干細(xì)胞的生物學(xué)特性

精原干細(xì)胞是由生殖嵴的原始生殖細(xì)胞（primordial germcells，PGCs）分化產(chǎn)生，PGCs先演化為性原細(xì)胞，性原細(xì)胞再發(fā)育為精原干細(xì)胞。精原干細(xì)胞體積大，外形為圓形或橢圓形，細(xì)胞核較大，核仁常位于細(xì)胞中央，線粒體和核糖體在胞質(zhì)中含量較多，細(xì)胞中其余細(xì)胞器不發(fā)達(dá)。一般將精原干細(xì)胞分為A、B兩型。A型細(xì)胞核染色質(zhì)細(xì)小，核仁?？拷四?，而B(niǎo)型細(xì)胞的核仁位于中央，核膜內(nèi)附著有粗大的異染色質(zhì)［2］。A型精原細(xì)胞可以分為單個(gè)A型（A-single，As）、成對(duì)A型（A-paired，Apr）、鏈狀A(yù)型（A-aligned，Aal），該3型細(xì)胞統(tǒng)稱未分化型精原干細(xì)胞。目前認(rèn)為，僅單個(gè)型（A-single）精原細(xì)胞具有干細(xì)胞性質(zhì)，因此，精原干細(xì)胞又被稱為As型精原細(xì)胞。As型細(xì)胞可以自我更新生成新的干細(xì)胞，也可以定向分化形成由兩細(xì)胞組成的Apr細(xì)胞，Apr進(jìn)一步分裂可形成由4、8、16細(xì)胞組成的Aal細(xì)胞，再分化形成A1、A2、A3、A4、In和B型細(xì)胞。B型細(xì)胞可分化為初級(jí)精母

細(xì)胞，再經(jīng)減數(shù)分裂最終形成精子［3］。As型細(xì)胞呈圓形或橢圓形，直徑9 μm±1 μm，胞質(zhì)較少；核大，核呈圓形或橢圓形，有2～3個(gè)核仁。Apr型細(xì)胞可見(jiàn)通過(guò)胞質(zhì)間橋相連。在電鏡下，可以觀察到精原細(xì)胞鑲嵌在支持細(xì)胞的側(cè)面，細(xì)胞核內(nèi)常染色質(zhì)較多，異染色質(zhì)少，核仁呈網(wǎng)狀，有時(shí)有空泡［4］。有資料表明［5］，睪丸中精原干細(xì)胞僅占其細(xì)胞總數(shù)的0.02%左右。

2 精原干細(xì)胞的分離純化與培養(yǎng)

2.1 精原干細(xì)胞的分離

目前對(duì)于精原干細(xì)胞的分離主要有3種方法，分別為兩步酶消化法、重力沉降法和單酶消化法。其中目前主要采用的為兩步酶消化法，不過(guò)有人用單酶消化法同樣獲得了較好的分離效果。

采用兩步酶消化法對(duì)各種動(dòng)物的精原干細(xì)胞進(jìn)行分離的結(jié)果不同。袁勁濤等［6］分離大鼠精原干細(xì)胞獲得精原干細(xì)胞純度為85%左右；張秀娟等［7］采用該方法成功分離了小鼠精原干細(xì)胞，最終檢測(cè)得出細(xì)胞活率≥90%。其次為重力沉降法，采用單位重力速度沉降法結(jié)合差異貼壁法純化豬的A型精原細(xì)胞，獲得高達(dá)95%～98%的純化率［8］。武小虎等［9］采用的是單酶消化法探究綿羊精原干細(xì)胞的分離，所得的細(xì)胞中PGP 9.5陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到了76.76%，較前人研究成果有所提高。

2.2 精原干細(xì)胞的純化

目前，精原干細(xì)胞的純化方法主要有Percoll離心、差異貼壁、盤(pán)化法、流式細(xì)胞分選、免疫磁珠分選、重力沉降法。利用免疫磁珠分離技術(shù)可以獲得較高濃度的精原干細(xì)胞，但用該方法進(jìn)行純化時(shí)不僅需要選擇特異性高的表面抗原，而且還需要專門(mén)的設(shè)備，另外還需要購(gòu)買一次性的分離柱和抗體標(biāo)記的磁珠，成本昂貴。利用流式細(xì)胞分選技術(shù)分離純化精原干細(xì)胞也可獲得大量較純的精原干細(xì)胞，不過(guò)需要購(gòu)買流式細(xì)胞儀，使成本增加。因此，目前對(duì)于動(dòng)物的精原干細(xì)胞的純化大都采用Percoll法、差速貼壁法和盤(pán)化法，其中以Percoll法和差速貼壁法最為常用。

不同動(dòng)物采用Percoll法獲得的純化效果不同。薛振華等［10］采用Percoll離心法對(duì)分離的達(dá)蘭豬精原干細(xì)胞進(jìn)行純化，純度可以達(dá)47.62%；Yu等［11］使用Percoll非連續(xù)密度梯度液獲得了90.48%的A型大鼠精原干細(xì)胞；張學(xué)明等［12］用Percoll非連續(xù)密度梯度得出小鼠的精原干細(xì)胞純度為68.76%；畢聰明等［13］對(duì)5月齡的牛生殖細(xì)胞用 Percoll非連續(xù)密度梯度法分離，純化后純度達(dá)69.27%；阿拉達(dá)爾［14］采用該方法純化山羊精原干細(xì)胞，最終純度達(dá)84%。其次為差異貼壁法，鄭鵬等［15］使用該方法得到了純度為72%的新生牛精原干細(xì)胞。盤(pán)化法是利用抗原-抗體或配體-受體間的特異性結(jié)合，來(lái)進(jìn)行精原干細(xì)胞的分離純化。陳曉宇等［16］對(duì)于湖羊精原干細(xì)胞分離后做進(jìn)一步純化，得出盤(pán)化法處理過(guò)的細(xì)胞在形態(tài)上更為均一，所形成集落的AKP陽(yáng)性率也顯著高于差異貼壁法。

2.3 精原干細(xì)胞的培養(yǎng)

目前，能用作精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類較多，并且培養(yǎng)基內(nèi)的添加成分各異，但一般采用DMEM為基本培養(yǎng)基，也有采用MEM培養(yǎng)基的。Lzadyar等［17］對(duì)牛精原干細(xì)胞的基本培養(yǎng)條件進(jìn)行了探索，認(rèn)為牛精原干細(xì)胞的最佳培養(yǎng)基為含2.5%血清的MEM培養(yǎng)基。Kanatsu-Shinohara等［18］使用 StemPro-34 SFM 和StemPro-34 supplement建立起的小鼠精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，不但能使精原干細(xì)胞存活（6個(gè)月以上），并且還維持了精原干細(xì)胞分化的多能性。Izadyar等［19］用MEM培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞也取得了不錯(cuò)的成果。

精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)一般都使用飼養(yǎng)層細(xì)胞來(lái)抑制精原干細(xì)胞分化和保持其增殖能力。常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有支持細(xì)胞、小鼠成纖維細(xì)胞（MEF）、STO飼養(yǎng)細(xì)胞和SNL飼養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)于添加劑的使用，一般都要在精原干細(xì)胞培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清。但有研究發(fā)現(xiàn)，血清可導(dǎo)致精原干細(xì)胞分化［20］，因此精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)基中添加血清的作用還有待進(jìn)一步研究。培養(yǎng)基中還需添加一些促細(xì)胞生長(zhǎng)試劑，如丙酮酸鈉、非必需氨基酸、谷氨酰胺和β-巰基乙醇等，同時(shí)還要添加細(xì)胞因子，如白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子 -1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、GDNF（glial cell line-derived neurotrophic factor）、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF）、顆粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等。而有研究表明，LIF、bFGF和IGF-1對(duì)體外培養(yǎng)精原干細(xì)胞的作用不明顯甚至有負(fù)作用［21］。Shinohara等［22］建立了不使用飼養(yǎng)層細(xì)胞及血清的培養(yǎng)體系。這是精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)的一項(xiàng)巨大進(jìn)步。

3 精原干細(xì)胞的移植

1994 年，Brinster等［23-24］發(fā)表了精原干細(xì)胞移植的新方法，實(shí)現(xiàn)了供體小鼠的精原干細(xì)胞在受體中進(jìn)行精子發(fā)生和單倍體的生殖遺傳。其后，也有報(bào)道將小鼠和倉(cāng)鼠精原干細(xì)胞移入大鼠睪丸后，成功產(chǎn)生了供體精子［25］，但公豬、公牛、大鼠、猴子以及公馬的精原干細(xì)胞也成功地移植入小鼠睪丸中，卻不產(chǎn)生供體精子，這就表明現(xiàn)階段較大種間跨度的精原干細(xì)胞異體移植還不產(chǎn)生精子發(fā)生過(guò)程。有研究表明，在小鼠［26］、大鼠［27］豬［28］、山羊［29］、狗［30］等物種的同種異體移植均獲得了成功。

精原干細(xì)胞移植方法主要有3種，最早采用的是曲精細(xì)管注射法。Brinster等［23-24］在1994年采用該種方法對(duì)小鼠的精原干細(xì)胞進(jìn)行了移植，其主要操作方法是，將供體小鼠的精原干細(xì)胞用解剖顯微鏡注射裝置直接注射到受體小鼠的曲精細(xì)管中。該研究的成功表明，將供體睪丸中的精原干細(xì)胞移植到受體睪丸中，能在受體睪丸中進(jìn)行正常的精子發(fā)生過(guò)程，產(chǎn)生的供體精子能夠成功使卵子受精產(chǎn)生供體后代。

另兩種移植方法為睪丸輸出管注射法和睪丸網(wǎng)注射法。輸出管注射法操作比較復(fù)雜，手術(shù)要求較高，不過(guò)其比曲精細(xì)管注射法快速可靠，適用范圍較廣。1995年，Jiang等［31］將供體大鼠的雄性生殖細(xì)胞采用睪丸網(wǎng)注射法轉(zhuǎn)移到受體睪丸。睪丸網(wǎng)注射法既不需要顯微操作儀的幫助，也不需要像輸出管注射法那樣復(fù)雜的解剖，是更加快速方便的方法。對(duì)于像牛羊等一些大型動(dòng)物的軸形睪丸網(wǎng)位于睪丸內(nèi)部深處，比較難以操作的問(wèn)題，Schlatt等［32］采用了超聲波成像引導(dǎo)注射法，成功地將供體的生殖細(xì)胞注入受體睪丸的曲精細(xì)管中，曲精細(xì)管充滿度高達(dá)70%。

精原干細(xì)胞移植的受體大都為內(nèi)源性精子發(fā)生缺陷的動(dòng)物，或者用射線照射等人為殺死大部分內(nèi)源性精原干細(xì)胞的動(dòng)物。但許多其他物種的移植都未進(jìn)行免疫抑制，也獲得了成功［33］，因此對(duì)于供體精原干細(xì)胞得到免疫豁免機(jī)制的原因需進(jìn)一步探究。

4 精原干細(xì)胞研究前景

精原干細(xì)胞的研究前景十分廣闊，目前對(duì)于哺乳類動(dòng)物精原干細(xì)胞的研究較嚙齒類動(dòng)物略微落后，不過(guò)它的發(fā)展空間更為廣闊。通過(guò)對(duì)精原干細(xì)胞的生物學(xué)特性的了解，尋找更為合適的分離純化方法，以及逐步完善精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，從而建立干細(xì)胞系，最終獲得臨床應(yīng)用，對(duì)瀕危動(dòng)物的保護(hù)，不孕癥的治療，干細(xì)胞的定向分化與應(yīng)用都有極其深遠(yuǎn)的意義，在干細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、畜牧業(yè)等領(lǐng)域具有重要價(jià)值。但是將精原干細(xì)胞應(yīng)用于臨床尚有倫理、遺傳、感染等方面的問(wèn)題，移植的精原干細(xì)胞是否會(huì)受體外環(huán)境的影響產(chǎn)生基因突變，改變遺傳信息，是否會(huì)感染未知的病毒等問(wèn)題都有待于進(jìn)一步研究。

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Advance in Spermatogonial Stem Cells

SongRui-gao，YaoXiao-lei，Shi Lei
（College ofAnimal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Spermatogonial stemcells are oocytes ofmale mamals germcells which not onlycan maintain the number ofthemselves but also can differentiate to spermatocyte.Spermatogonial stem cells are also closely related to the genetic background of the next male generation individuals.Therefore，the study of spermatogonial stem cells in the field of cell biology，medicine and transgene has broad application prospects.In this review，biological characteristics，isolation，purification，cultivation and transplantation of spermatogonial stemcells were discussed.

spermatogonial stemcells；biological characteristics；isolation；purification；cultivation；transplantation

Q2

A

2095-3887（2014）05-0054-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.017

2014-06-09

山西省青年基金項(xiàng)目（2012021027-6）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金（201201）

宋瑞高（1990-)，男，碩士研究生。

石磊（1980-），男，副教授，博士。主要從事動(dòng)物生殖生理和繁殖營(yíng)養(yǎng)調(diào)控等方面的研究。