山羊偽結(jié)核棒狀桿菌的分離鑒定

李文楊，劉 遠，張曉佩，高承芳，陳鑫珠，董曉寧

（福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013）

山羊偽結(jié)核棒狀桿菌的分離鑒定

李文楊，劉 遠，張曉佩，高承芳，陳鑫珠，董曉寧

（福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013）

從福建省不同羊場的山羊頸肩部淋巴結(jié)膿腫處分離到5株無莢膜、不形成芽孢的革蘭氏陽性球桿菌，該菌在含血清的瓊脂培養(yǎng)基上，可生長成直徑1～2 mm、干燥、中央凸起、不透明、邊緣不整齊、伴有β溶血環(huán)的菌落，而在普通培養(yǎng)基上生長不良，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上不能生長。根據(jù)其形態(tài)學、培養(yǎng)特性、生化特性及致病性試驗和動物回歸試驗結(jié)果，判定所分離的5株菌為山羊偽結(jié)核棒狀桿菌。

山羊；偽結(jié)核棒狀桿菌；分離；鑒定

偽結(jié)核棒狀桿菌病是由偽結(jié)核棒狀桿菌引起的人和多種動物共患的一種接觸性慢性細菌性傳染病。感染羊以局部淋巴結(jié)發(fā)生膿腫、干酪樣壞死以及消瘦為特征。近年來，該病在散養(yǎng)、環(huán)境條件差的養(yǎng)羊場發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重影響了養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟效益。其臨床癥狀主要是感染羊頭頸部或肩前淋巴結(jié)和股前淋巴結(jié)出現(xiàn)大小不等的膿腫，觸之堅硬或有波動感，隨著病程延長，膿腫逐漸增大，最后形成如雞蛋大小的膿皰，切開膿皰，流出乳白色粘性液體甚至干酪樣膿汁。病羊常因患處腫脹發(fā)癢而在圍墻或欄桿上摩擦，而引起膿皰破潰，影響采食和休息，感染嚴重時表現(xiàn)為咳嗽、食欲下降、體重減輕，膿腫破潰后若波及內(nèi)臟可引起死亡。偽結(jié)核棒狀桿菌感染病羊常規(guī)外科手術(shù)處理易復發(fā)，藥物治療效果不顯著。為了研究該病，對山羊的典型病例進行了病原菌的分離與鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料及病料

1.1.1 病料采集 從福建省福清、仙游、福安、尤溪和建陽等地羊場的山羊耳下、肩前及膝前淋巴結(jié)膿腫處，局部剪毛、消毒，然后用滅菌注射器從膿皰中采集膿汁，置于滅菌試管內(nèi)進行病原菌的分離培養(yǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、牛血清馬丁肉湯和全血瓊脂平板等培養(yǎng)基均由本所實驗室配制。

1.1.3 微量發(fā)酵管 葡萄糖、阿拉伯糖、山梨酸、棉子糖、鼠李糖、麥芽糖、甘露糖、乳糖、蔗糖、枸櫞酸鹽等微量生化培養(yǎng)管均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.4 藥敏紙片 頭孢噻肟鈉、慶大霉素、環(huán)丙沙星、恩洛沙星、青霉素、鏈霉素、呋喃妥因、硫酸新霉素、氟哌酸、氧氟沙星等藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.5 試驗動物 試驗用1.5 kg左右家兔和6月齡左右山羊均購自非免疫偽結(jié)核棒狀桿菌疫苗的健康養(yǎng)殖場。

1.2 實驗室檢查

1.2.1 染色鏡檢 取一定量的膿汁用生理鹽水作適當稀釋后直接涂片，用革蘭氏染色法染色鏡檢。

1.2.2 細菌的分離培養(yǎng) 將無菌采集的膿汁分別接種于普通瓊脂平板、10%犢牛血清瓊脂平板和麥康凱平板上，置37℃恒溫箱培養(yǎng)，然后挑取單個優(yōu)勢菌落接種于普通肉湯、10%犢牛血清肉湯及瓊脂平板上進行純培養(yǎng)，并涂片鏡檢。

1.2.3 生化試驗 取上述純培養(yǎng)物，按常規(guī)方法接種于生化試驗培養(yǎng)基中培養(yǎng)24～48 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 藥敏試驗 用常規(guī)紙片法對上述分離菌進行藥敏試驗。

1.3 動物試驗

1.3.1 對兔的致病性試驗 取血清肉湯48 h純培養(yǎng)物以腹腔注射2.0 mL接種于3只肉兔，另設(shè)3只對照。每日觀察肉兔發(fā)病情況并記錄。

1.3.2 動物回歸試驗 取血清肉湯48 h純培養(yǎng)物以頸部皮下注射2.0 mL接種于2只肉羊，另設(shè)2只對照。每日觀察肉羊發(fā)病情況并記錄。

2 結(jié)果

2.1 染色鏡檢

經(jīng)革蘭氏染色鏡檢可見大量棒狀或球桿狀、菌落為

細小顆粒樣、不透明、邊緣不整齊、淡白色的革蘭氏陽性菌，無芽孢、鞭毛及莢膜，散在或呈“V”字型排列。

2.2 細菌的分離培養(yǎng)

血清瓊脂平板上經(jīng)37℃、18～24 h的培養(yǎng)，可見菌落白色，干燥、凸起、半透明，直徑1～2 mm，隨培養(yǎng)時間延長菌落變?yōu)椴煌该?，呈乳白色。菌落表現(xiàn)松軟、易碎、易推動，很難挑起，菌落周圍具有狹窄的β溶血環(huán)。普通瓊脂平板上生長貧瘠，而在麥康凱平板上未見細菌生長。

普通肉湯和血清肉湯在37℃培養(yǎng)24 h后可見輕度渾濁，血清肉湯混濁更明顯，且有白色菌膜出現(xiàn)。在37℃培養(yǎng)48 h后血清肉湯上部逐漸變清，管底有顆粒樣沉淀生成，菌膜進一步增厚。

2.3 生化試驗

結(jié)果見表1。

表1 5株分離菌株生化試驗結(jié)果

2.4 藥敏試驗

5株分離菌藥敏試驗結(jié)果基本一致，各藥敏紙片的抑菌圈直徑分別為頭孢噻肟鈉32 mm、硫酸新霉素30 mm（高敏），環(huán)丙沙星16 mm、氟苯尼考15 mm（中度敏感），紅霉素5 mm（低敏），而妥布霉素、四環(huán)素、氧氟沙星、恩洛沙星、哌拉西林、利高霉素、慶大霉素、利福平、氟哌酸、青霉素G、鏈霉素、磺胺類和呋喃妥因均無抑制圈。

2.5 動物試驗

接種血清肉湯純培養(yǎng)物的肉兔，80～116 h內(nèi)陸續(xù)死亡，剖檢后可見肝臟、肺臟及腎臟表面有直徑1～3 mm白色稍凸起的結(jié)核樣病變，挑破后有膿汁流出；接種部位出現(xiàn)化膿灶，后期切開見有白色牙膏樣膿汁。

人工感染山羊在15 d內(nèi)未見明顯臨床癥狀，但其采食明顯減少。在第16～18天，接種部位及周邊的淺表淋巴結(jié)出現(xiàn)膿腫，膿腫表面有厚而致密的炎性纖維素性肉芽腫性包囊，觸摸堅硬，隨著時間推移腫塊變大，與周圍組織界限變得分明，大小如核桃或雞蛋大；在第23～25天時部分膿腫破潰，流出黃白色無臭無味的黏稠液體，似干酪樣，并將膿汁取出培養(yǎng)后分離到與原攻擊菌相同的細菌［1］。

3 小結(jié)與討論

1）根據(jù)流行病學調(diào)查、臨床癥狀、病理變化以及分離菌形態(tài)、培養(yǎng)特性、生化特性、動物試驗與《伯杰細菌鑒定手冊》描述的偽結(jié)核棒狀桿菌特征基本一致，可判定從發(fā)病羊場不同山羊分離的5菌株均為偽結(jié)核棒狀桿菌［2］。

2）羊偽結(jié)核棒狀桿菌主要引起綿羊、山羊發(fā)生以干酪樣淋巴結(jié)炎為特征的慢性傳染病。美國、澳大利亞及日本等國家或地區(qū)均有該病發(fā)生。臨床上該病發(fā)展緩慢，在感染初期不易察覺，容易被人們忽視，但由于偽結(jié)核棒狀桿菌可產(chǎn)生壞死性、溶血性外毒素，嚴重影響患病羊的生長發(fā)育。因此，早期發(fā)現(xiàn)極為重要。李國平在2004年從上海引進的波爾山羊中首次分離出羊偽結(jié)核棒狀桿菌，證明該菌在福建省存在，近年來有擴大趨勢［3］。

3）偽結(jié)核棒狀桿菌主要通過山羊皮膚創(chuàng)口、粘膜或注射等途徑侵入羊體內(nèi)，除在感染部位形成局灶性膿腫外，還會順著淋巴管侵入淋巴結(jié)引起淋巴結(jié)腫大化膿，若感染部位較深或羊體抵抗力較差時，該菌還會經(jīng)淋巴和血管侵入體內(nèi)的淋巴結(jié)和內(nèi)臟，雖然病死率不高，但嚴重影響患羊的健康。由于偽結(jié)核棒狀桿菌引起的山羊皮下、淋巴膿腫病病灶在形成過程中，表面會形成一層厚而致密的纖維性肉芽腫性包囊，諸多藥物都難以通過這層包囊滲入其內(nèi)，使藥物不能均勻地擴散于整個膿腫腔，給治療造成一定難度，因此在生產(chǎn)上需要尋求一種快速有效的治療方法。

4）在養(yǎng)羊生產(chǎn)中，由于絕大多數(shù)養(yǎng)羊戶僅注重一些危害嚴重疫病的防治，而忽視諸如偽結(jié)核棒桿菌病等危害相對較小疫病的防治。雖然偽結(jié)核棒桿菌引起的發(fā)病率較高，而致死率較低，常被人們忽視，但它卻又是世界公認的難以防治的傳染病之一，一旦侵入羊群則很難徹底清除，給養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展造成較大危害，應(yīng)引起廣大養(yǎng)殖戶的高度重視［4］。目前本病還沒有供臨床使用的疫苗，應(yīng)搞好環(huán)境消毒，以預(yù)防為主，防止外傷發(fā)生是預(yù)防本病的關(guān)鍵。

［1］王志芳，楊增岐，宋志軍，等.羊偽結(jié)核病病原的分離鑒定［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學報，2004，26（5）：365-367．

［2］R E布坎南.伯杰細菌鑒定手冊［M］.8版.中國科學院微生物研究所，譯.北京：科學出版社，1984：833-844.

［3］李國平，陳家祥，王全溪.波爾山羊偽結(jié)核棒狀桿菌在我省的首次分離鑒定［J］.福建畜牧獸醫(yī)，2003，25（5）：1-2.

［4］王韡，張彥明，邢福珊，等.羊偽結(jié)核棒狀桿菌的分離鑒定及ELISA檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)學報，2005，25（1）：34-36.

S858.27

A

2095-3887（2014）05-0049-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.015

2014-07-14

李文楊（1972-），男，副研究員，碩士，主要從事草食動物研究。