肝豆狀核變性的分子遺傳學研究進展

沈博 陳晨 吳瑢 肖佳佳 王曉平

肝豆狀核變性的分子遺傳學研究進展

沈博 陳晨 吳瑢 肖佳佳 王曉平

肝豆狀核變性（hepatolenticular degeneration，HLD）又名威爾遜?。╓ilson disease，WD），為7基因缺陷導致的一種常染色體隱性疾病，在國際上屬于罕見疾病，在中國是神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病中僅次于肌營養(yǎng)不良的第二常見疾病。其特征為膽汁銅排泄和肝內銅藍蛋白合成障礙導致過量的銅在肝臟、腦、角膜等組織器官內積蓄，導致肝病及錐體外系癥狀等肝外表現(xiàn)。早期診斷與排銅治療對改善WD患者預后意義重大，然而該疾病復雜的表現(xiàn)型使其診斷頗為困難，不同個體間的疾病轉歸也可迥異。近十年來，分子遺傳學方法與臨床疾病研究的結合愈發(fā)緊密，從分子水平準確識別并預測疾病的發(fā)展，進而采取更為有效的個體化干預，是分子遺傳學研究向臨床轉化的核心。本文就WD的分子遺傳學研究現(xiàn)狀進行簡要綜述。

肝豆狀核變性；銅藍蛋白；基因型；表現(xiàn)型；基因診斷。

肝豆狀核變性（hepatolenticular degeneration，HLD）又名威爾遜病（Wilson disease，WD），是7基因缺陷導致的一種致命性常染色體隱性遺傳病，該疾病在全球范圍內均有分布，好發(fā)于兒童及青少年，3～80歲均有報道。男性患病率略高于女性，這可能是雌激素水平以及鐵代謝差異的結果［1］。經(jīng)典的WD患病率約1/30000，攜帶頻率約0.011，基因頻率約0.56。最近一項英國的臨床研究對 WD發(fā)病率重新進行了評估，當?shù)仉S機抽選的6000余人分別采取7基因全長和熱區(qū)8、14和18號外顯子直接測序，前者攜帶頻率為0.024～0.056，后者則僅為0.0044～0.0057，這意味著理論上WD的患病率不應低于1/7000，確診病例數(shù)與理論發(fā)病率的差距可能來源于外顯率下降與診斷的局限性［2］。

WD的臨床表現(xiàn)高度多變，主要分為肝型和神經(jīng)型，肝型表現(xiàn)為急、慢性肝病，如爆發(fā)性肝衰竭（fulminant hepatic failure，F(xiàn)HF）、肝硬化等，神經(jīng)系統(tǒng)癥狀主要包括運動障礙和肌張力障礙的椎體外系癥狀，精神癥狀多伴隨神經(jīng)癥狀出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為認知、心境異常［3］，少數(shù)患者還可出現(xiàn)溶血性貧血和骨骼肌肉異常。

WD患者一經(jīng)確診，需要終身接受低銅飲食并排銅治療，絕大多數(shù)患者癥狀得到改善，生活質量能夠明顯改善。

1 WD的基因

我國的突變熱區(qū)分布于2、5、8-13、16、18、19號外顯子，有研究者在對73位南方WD患者的7完整測序后，發(fā)現(xiàn)32位患者存在R778L突變（34/146，23.29%），次常見突變類型為I1148T（14/146，9.59%）［4］；隨后另有研究者對我國北方WD患者的基因型研究中進一步證實R778L突變與L770L連鎖緊密，是我國最常見的突變類型，其余常見的突變還包括A874V和P992L［5］。

2 ATP7B蛋白的結構和功能

銅作為人體內重要的微量元素，處于穩(wěn)態(tài)時參與線粒體呼吸鏈、神經(jīng)遞質合成以及鐵代謝等重要的細胞代謝過程，一旦過度蓄積則通過Haber-Weiss反應加速活性氧生成，對細胞DNA、線粒體造成氧化損傷，誘導細胞凋亡。當肝細胞胞內銅濃度正?；蚱蜁r，胞漿內銅離子泵入TGN，與前銅藍蛋白結合形成一種6分子銅結合蛋白，即完全銅藍蛋白，后者將血漿中95%以上的銅轉運至各器官。高銅環(huán)境下銅離子則以膜泡形式從肝細胞分泌至膽小管，通過膽汁排出體外，維持胞內銅穩(wěn)態(tài)。ATP7B功能結構一旦受損即可出現(xiàn)銅藍蛋白下降和肝銅超載，進而引發(fā)各類WD臨床表現(xiàn)。

3 WD基因型-表現(xiàn)型關聯(lián)

WD的表現(xiàn)型十分復雜，可概括為起病年齡范圍廣，臨床表現(xiàn)多樣以及代謝紊亂程度差異大。一方面，7多達500余種突變對ATP7B的結構功能所造成的影響并不相同：結構影響如ATP7B完整性喪失、錯誤折疊、蛋白間作用受損，功能影響如磷酸化或銅轉運異常，ATP結合力下降，胞內轉運障礙等［8］。另一方面，可能還存在7之外的修飾基因，證據(jù)在于WD基因型相同的WD患者，甚至同卵雙生子之間也可能存在迥異的表現(xiàn)型［9］。此外，線粒體DNA突變以及環(huán)境作用也會對WD表現(xiàn)型造成重要影響。

E1064同樣位于N區(qū)SEHPL模體，該突變可導致ATP結合力完全喪失而出現(xiàn)癥狀嚴重的臨床表型，據(jù)報道1例16歲E1064K純合的男性WD患者表現(xiàn)出致死性FHF［15］。然而，盡管該突變與其下游的H1069位點非常臨近，卻并未改變N區(qū)的蛋白折疊，且E1064A突變體的熱穩(wěn)定性和胞內定位與野生型相比并無明顯異常［16］。

R778L位于8號外顯子，等位基因頻率在14%～49%［11］。位于M2跨膜螺旋體的精氨酸殘基被亮氨酸替換，可能影響Cu+的跨膜運輸。R778L與L770L高度連鎖，這種東亞特有的單倍型可能來自5500年前的共同祖先［17］。我國學者Liu等［18］的兩組研究報道均提示R778 L突變與肝型WD相關，值得注意的是，兩次研究中納入的患者起病年齡較輕，分別為16歲前起病占55/57，18歲前起病占72/75，這可能造成研究結論的偏倚。

M區(qū)的G943S和M769 V突變體表現(xiàn)為銅代謝異常，而其血漿銅藍蛋白水平多正常。撒丁島人群的常見突變?yōu)閱幼訁^(qū)-441/-427del，可能通過改變ATP7B的表達水平導致WD的發(fā)生。移碼突變、無義突變，插入缺失及剪切點突變等常造成編碼蛋白截斷，導致起病時間更早，代謝異常更為嚴重，表現(xiàn)為FHF等嚴重臨床表型也更多見［19］。

3.2 修飾基因 修飾基因是加重或緩解其他致病基因表型的一組基因。位于19q13.2的apoE是與WD相關性最強的修飾基因，該基因座主要存在ε2、ε3、ε4三種共顯性基因，ε3、ε3/3分別為最常見的等位基因和基因型，其編碼載脂蛋白E，在脂質代謝中發(fā)揮重要作用。ε4被認為與脂質紊亂、神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茲海默病的發(fā)生有關。有研究表明基因型為ε3/3的WD患者起病年齡較晚，可能是載脂蛋白E3具有抗氧化及神經(jīng)修復功能的保護效應［20］。Litwin等［21］的研究成果顯示：ε4陽性的女性WD患者與野生型ε3/3相比平均起病時間早4年，且在H1069Q純合子的患者中更為明顯。該研究者推測，雌激素對神經(jīng)生長所具有的保護效應只在ε3/3基因型中生效，而ε4陽性基因型剝奪了這一保護機制造成機體對毒性物質耐受力下降。

朊病毒相關蛋白曾在體外研究中被證實具有銅離子結合能力，可能參與人體銅穩(wěn)態(tài)的調節(jié)。編碼該蛋白的PRP基因129密碼子存在多態(tài)性，此處的蛋氨酸（M）如被纈氨酸（V）替代可以導致WD起病時間提前約5年，但不改變癥狀表型［22］。

關于WD基因型-表型聯(lián)系的研究中大多數(shù)結論尚未有定論。一方面，確定起病年齡及臨床表型絕非易事，常因接診醫(yī)生的差異而具有明顯的主觀性；另一方面，因為WD發(fā)病率偏低，更為罕見的基因型只能通過生物信息學技術或異種同源蛋白進行預測，難以在統(tǒng)計學上與表現(xiàn)型建立關聯(lián)。此外，疾病表現(xiàn)型不能簡單還原為特定的基因型，而是亞細胞水平動態(tài)的、復合的外顯。建立基因型-表型關聯(lián)有賴于更實用的 WD臨床分型，更廣泛的科研臨床合作以及更深入的分子機制研究。

4 WD基因診斷的方法與評價

由歐洲肝臟病學會出臺的最新肝豆狀核變性治療指南中，基因檢測陽性在診斷量表中被賦予了最高的權重［25］。WD的基因檢測方法可以分為直接測序和單體型分析兩大類。直接測序能夠明確突變的具體類型，是目前診斷WD的標準方法，由于WD基因外顯子區(qū)長達4.3 kb，通常僅針對突變熱點測序以期在保證準確性的同時實現(xiàn)高效經(jīng)濟。單體型分析是通過靶基因內部或側翼的分子標記實施檢測獲取遺傳信息，通常選用7側翼的微衛(wèi)星序列或其內部SNP位點做標記，單體型分析不需要明確突變類型，適用于對已經(jīng)確診WD患者的親屬進行篩查，其缺點在于對低概率基因重組可能造成假陰性結果。此外，新一代測序技術能實現(xiàn)全外顯子乃至全基因組測序，未來WD的基因診斷必將更及時而全面。

WD傳統(tǒng)診斷依賴臨床癥狀和生化指標，然而，同時出現(xiàn)血清銅藍蛋白水平降低、神經(jīng)系統(tǒng)與角膜K-F環(huán)三聯(lián)征的患者并不多見，大部分患者早期僅為不明原因的肝功能異常或銅藍蛋白水平下降，此時基因檢測結果往往起決定性作用［26］。未經(jīng)治療的WD致死率極高，對確診WD患者的親屬實行基因檢測可以避免對雜合子實施不必要治療。目前 WD的產(chǎn)前診斷尚未列入常規(guī)推薦。然而，鑒于7基因具有明顯的異質性，啟動子等非翻譯區(qū)突變也屢有報道，基因診斷的陰性結果并不能完全排除WD的可能。進一步確立WD高頻突變類型和地域、人種及疾病表型的關系將非常有助于提高基因診斷的準確性與實用性。

總之，WD在我國較為常見，是目前少數(shù)能得到有效治療的神經(jīng)遺傳病。早期診斷及排銅治療能顯著改善這類患者的預后，如何做到早期識別診斷、準確預測病程進展并采取有效治療，是分子遺傳學研究向臨床轉化的切入點。目前對于WD基因型-表現(xiàn)型關聯(lián)的報道大都效力不足，進一步開展分子遺傳學研究從分子層面闡明疾病機制，可能更將有助于臨床基因診斷，為干細胞移植、基因治療等新興治療方式提供助力。

［1］Litwin T，Gromadzka G，Czlonkowska A.Gender differences in Wilson's disease［J］.J Neurol Sci，2012，312（1-2）：31-35.

［2］Coffey AJ，Durkie M，Hague S，et al.A genetic study of Wilson's disease in the United Kingdom［J］.Brain，2013，136（Pt 5）：1476-1487.

［3］王曉平，蔣玉美，李文杰.幾種基底神經(jīng)節(jié)相關疾病的神經(jīng)精神癥狀［J］.中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志，2010，4：286-289.

［4］Wang LH，Huang YQ，Shang X，et al.Mutation analysis of 73 southern Chinese Wilson's disease patients：identification of 10 novel mutations and its clinical correlation［J］.J Hum Genet，2011，56（9）：660-665.

［5］Li K，Zhang WM，Lin S，et al.Mutational analysis of ATP7B in north Chinese patients with Wilson disease［J］.J Hum Genet，2013，58（2）：67-72.

［6］Hatori Y，Majima E，Tsuda T，et al.Domain organization and movements in heavy metal ion pumps：papain digestion of Cop A，a Cu+-transporting ATPase［J］.J Biol Chem，2007，282（35）：25213-25221.

［7］Gourdon P，Liu XY，Skjorringe T，et al.Crystal structure of a copper-transporting PIB-type ATPase［J］.Nature，2011，475（7354）：59-64.

［8］Huster D，Kuhne A，Bhattacharjee A，et al.Diverse functional properties of Wilson disease ATP7B variants［J］. Gastroenterology，2012，142（4）：947-956；e5.

［9］Czlonkowska A，Gromadzka G，Chabik G.Monozygotic female twins discordant for phenotype of Wilson's disease［J］. Mov Disord，2009，24（7）：1066-1069.

［10］Lee BH，Kim JH，Lee SY，et al.Distinct clinical courses according to presenting phenotypes and their correlations to ATP7B mutations in a large Wilson's disease cohort［J］.Liver Int，2011，31（6）：831-839.

［11］Ferenci P.Regional distribution of mutations of the ATP7B gene in patients with Wilson disease：impact on genetic testing［J］.Hum Genet，2006，120（2）：151-159.

［12］Rodriguez-Granillo A，Sedlak E，Wittung-Stafshede P.Stability and ATP binding of the nucleotide-binding domain of the Wilson disease protein：effect of the common H1069Q mutation［J］.J Mol Biol，2008，383（5）：1097-1111.

［13］Stapelbroek JM，Bollen CW，van Amstel JK，et al.The H1069Q mutation in ATP7B is associated with late and neurologic presentation in Wilson disease：results of a meta-analysis［J］.J Hepatol，2004，41（5）：758-763.

［14］Mihaylova V，Todorov T，Jelev H，et al.Neurological symptoms，genotype-phenotype correlations and ethnic-specific differences in Bulgarian patients with Wilson disease［J］. Neurologist，2012，18（4）：184-189.

［15］Firneisz G，Szonyi L，F(xiàn)erenci P，et al.The other mutation is found：follow-up of an exceptional family with Wilson disease［J］.Am J Gastroenterol，2004，99（12）：2504-2505.

［16］Dmitriev OY，Bhattacharjee A，Nokhrin S，et al.Difference in stability of the N-domain underlies distinct intracellular properties of the E1064A and H1069Q mutants of coppertransporting ATPase ATP7B［J］.J Biol Chem，2011，286（18）：16355-16362.

［17］Mak CM，Lam CW，Tam S，et al.Mutational analysis of 65 Wilson disease patients in Hong Kong Chinese：identification of 17 novel mutations and its genetic heterogeneity［J］.J Hum Genet，2008，53（1）：55-63.

［18］Liu XQ，Zhang YF，Liu TT，et al.Correlation of ATP7B genotype with phenotype in Chinese patients with Wilson disease［J］.World J Gastroenterol，2004，10（4）：590-593.

［19］Okada T，Shiono Y，Kaneko Y，et al.High prevalence of fulminant hepatic failure among patients with mutant alleles for truncation of ATP7B in Wilson's disease［J］.Scand J Gastroenterol，2010，45（10）：1232-1237.

［20］Wang XP，Wang XH，Bao YC，et al.Apolipoprotein E genotypes in Chinese patients with Wilson's disease［J］.Qjm，2003，96（7）：541-542.

［21］Litwin T，Gromadzka G，Cz?onkowska A.Apolipoprotein E gene（APOE）genotype in Wilson's disease：impact on clinical presentation［J］.Parkinsonism Relat Disord，2012，18（4）：367-369.

［22］Merle U，Stremmel W，Gessner R.Influence of homozygosity for methionine at codon 129 of the human prion gene on the onset of neurological and hepatic symptoms in Wilson disease［J］.Arch Neurol，2006，63（7）：982-985.

［23］Gromadzka G，Rudnicka M，Chabik G，et al.Genetic variability in the methylenetetrahydrofolate reductase gene（MTHFR）affects clinical expression of Wilson's disease［J］.J Hepatol，2011，55（4）：913-919.

［24］Gromadzka G，Cz?onkowska A.Influence of IL-1 RNIntron 2 variable number of tandem repeats（VNTR）polymorphism on the age at onset of neuropsychiatric symptoms in Wilson's disease［J］.Int J Neurosci，2011，121（1）：8-15.

［25］European Association for Study of L.EASL Clinical Practice Guidelines：Wilson's disease［J］.J Hepatol，2012，56（3）：671-685.

［26］周怡言，王曉平.低銅藍蛋白血癥及基因研究的進展［J］.中華神經(jīng)科雜志，2012，45（6）：429-431.

R742.4

：A

：1006-2963（2014）06-0437-04

2014-02-16）

（本文編輯：鄒晨雙）

10.3969/j.issn.1006-2963.2014.06.015

200080上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院神經(jīng)科

王曉平，Email：x_p_wang@sjtu.edu.cn