微生物末端限制性片段的長度多態(tài)性研究新進展

陳尚坤

(吉林警察學院，吉林長春 130117)

微生物末端限制性片段的長度多態(tài)性研究新進展

陳尚坤

(吉林警察學院，吉林長春 130117)

有效的比對不同環(huán)境下微生物群落基因組間的差異，可為刑事偵查中鑒定不同物證的來源或異同，提供有效的分析思路;微生物基因組16S rRNA有多個區(qū)段高度保守，可以設(shè)計出通用引物，擴增所有細菌的16S rRNA片段，而16S rRNA可變區(qū)的差異則可以用來區(qū)分不同的細菌;近年來發(fā)展起來的T-RFLP(末端標記限制性片段長度多態(tài)性)技術(shù)為該策略的實施提供了新的技術(shù)平臺;本文對近年來T-RFLP分析的研究進展進行了系統(tǒng)回顧，對其關(guān)鍵技術(shù)，包括引物及限制酶的選擇、末端片段的解析、信號的區(qū)分以及圖譜的解讀等方面的最新研究方法進行了系統(tǒng)的比較和評價，以期為其在法庭科學中的實踐提供相應(yīng)的參考和幫助。

微生物群落;16S rRNA;末端限制性片段的長度多態(tài)性(T-RFLP);多樣性

0 引言

在大量刑事案件中，犯罪嫌疑人為了逃避打擊，往往毀滅證據(jù)，或者轉(zhuǎn)移尸體等與犯罪有關(guān)的證據(jù)。犯罪嫌疑人在進出現(xiàn)場的過程中，鞋或者衣物會粘附有現(xiàn)場的泥土、水;轉(zhuǎn)移尸體等物品的過程中，嫌疑人、尸體等物體粘附有現(xiàn)場及所經(jīng)過地點的泥土、水。在一些交通肇事逃逸案件中，肇事車輛會被嫌疑人沖洗。而他們往往只注意車輛上的血跡，而不會注意所粘附的現(xiàn)場泥土。環(huán)境微生物學的研究說明泥土、水中分布有大量的微生物，而且呈多樣性分布，不同地區(qū)及同一地區(qū)不同地點所分布的微生物種類不同，菌株也不同。大量的微生物基因組測序顯示不同種類微生物的基因組序列存在差異，不同菌株的某些位置序列存在多態(tài)性。因此通過分析泥土、水中的微生物種類鑒別泥土的來源，無疑可為案件的偵破提供有力的線索和證據(jù)。

16S rRNA基因(rDNA)是最常用的作為細菌群落結(jié)構(gòu)分析的系統(tǒng)進化標記分子。目前，人們對細菌的16S rRNA序列已有了清晰的認識:該序列全長約1 540 bp，有多個區(qū)段高度保守。根據(jù)這些保守區(qū)可以設(shè)計出細菌的通用引物，用來擴增各種細菌的16S rRNA片段，而16S rRNA可變區(qū)的差異可以用來區(qū)分不同的細菌。

隨著核酸測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的rRNA基因序列被輸入數(shù)據(jù)庫。其中原核生物核糖體小亞基RNA的基因序列已達到20 000條以上。有了強大的數(shù)據(jù)庫支持，采用16S rRNA作目的序列進行細菌群落結(jié)構(gòu)分析就更加方便可靠。確定了合適的目的序列后，根據(jù)序列的保守區(qū)設(shè)計引物，其中一個引物的5＇端用熒光物質(zhì)標記，然后提取待分析樣品的總DNA，以它為模板進行PCR擴增，所得到的PCR產(chǎn)物一端就帶有這種熒光標記。然后，將PCR產(chǎn)物用合適的限制性內(nèi)切酶消化，由于在不同細菌的擴增片段內(nèi)存在核苷酸序列的差異，酶切位點會存在差異，酶切后就產(chǎn)生許多不同長度的限制性片段。消化產(chǎn)物用DNA自動測序儀(選用Genescan功能)進行檢測獲得峰值圖，末端帶熒光標記的片段(Terminal Restriction Fragment，T-RF)或者稱作操縱分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)被檢測到，而其他沒帶熒光標記的片段則檢測不到。因為一種細菌的T-RF長度是唯一的，所以峰值圖上的每一個峰至少代表了一種細菌。

在GeneScan的峰值圖上，每個峰所占據(jù)的面積占總面積的百分數(shù)就代表了這種T-RF的相對數(shù)量。雖然不同細菌基因組上16S rRNA以不同數(shù)量的多拷貝形式存在，導致了哪種細菌對應(yīng)的T-RF峰曲線下的面積大，該細菌的相對數(shù)量就大。據(jù)報道，峰值圖的重復性很高，因而該技術(shù)做定量分析是非常可靠的。

更為重要的是，在法科學實驗室應(yīng)用T-RFLP技術(shù)進行案件的調(diào)查時，只需要比對不同樣本的圖譜(Profile)是否具有相同的來源，而不必去明確每個特征峰所代表的具體微生物的種類。事實上，環(huán)境中的絕大多數(shù)微生物是不可培養(yǎng)的，可培養(yǎng)的微生物只占總量的0.1%～10%，這樣，應(yīng)用T-RFLP技術(shù)進行法科學分析，無疑獲得了比其他方法更多的信息。

1 引物的選擇

理想情況下，T-RFLP分析中引物的選擇應(yīng)該特定于相應(yīng)的目標分類群，但也需要足夠通用以便于它們可擴增所有相關(guān)細菌種群。目前沒有已知的引物可同時滿足這兩個標準。例如，通過使用探針匹配工具，在核糖體數(shù)據(jù)庫項目(RDP)中一個計算機模擬的測序分析后表明，常用的細菌引物8fm(引物命名基于大腸桿菌16S rRNA基因)潛在地只能擴增76%～98%的細菌16S rRNA基因序列［1］。另外，這個分析沒有考慮序列數(shù)據(jù)庫只包含部分現(xiàn)存的細菌多樣性，所以常用的引物如8fm不能完全滿足實踐的需要。另外，引物8fm對于細菌來說并非100%特定，因為它也匹配基因庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Gen bank/)中古細菌16S rRNA基因序列中的19個古細菌的16S rRNA基因。盡管沒有完美的引物，仍然有一些基于數(shù)據(jù)庫序列的工具以便研究者比較不同引物的特異性和敏感性，如在微生物群落分析(MiCA)網(wǎng)站(http:∥mica.ibest.uidaho.edu/)里的引物優(yōu)化工具［2］及核糖體數(shù)據(jù)庫項目網(wǎng)站(http:∥rdp.cme.msu.edu/)中的探針匹配工具［1］。不足之處在于目前尚無可以同時分析古細菌序列的工具。

如果僅使用一個熒光標記引物進行檢測，可能造成在一個樣本中低估微生物多樣性的結(jié)果。因為不同的菌群可由一個特定的引物酶切組合而產(chǎn)生相等的末端限制長度片段［1］。如果使用兩個標記引物可以削弱這個問題，前提是那些不可能被一個引物所區(qū)分的種群可以通過第二個標記引物產(chǎn)生的末端片段所提供的額外信息加以區(qū)分［3］。通過引入第三個或更多標記引物可以更進一步解決這一問題。例如，Zhou［4］應(yīng)用兩個獨立的PCR反應(yīng)以擴增人類陰道菌群的16S rRNA基因，這兩個PCR反應(yīng)采用兩個不同標記的正向引物結(jié)合相同的反向引物。消化后，兩個反應(yīng)的限制產(chǎn)物在分析前進行混合，分析取得了良好的效果。

相同的PCR反應(yīng)中也可以使用多個引物以研究總?cè)郝渲胁煌念惾?復合擴增)。如Singh［5］等針對細菌、古細菌和真菌，使用了3對不同的引物對土壤的生物群進行了復合擴增，并應(yīng)用3個獨立的PCR反應(yīng)及其產(chǎn)生的T-RFLP圖譜，對此復合擴增及其酶切的效能進行了評估，另外，他們還應(yīng)用單個PCR反應(yīng)的產(chǎn)物構(gòu)建DNA池進行了對比分析。結(jié)果顯示，單個反應(yīng)、復合擴增及PCR產(chǎn)物池的圖譜，在代表樣本中不同微生物的峰的數(shù)目、位置及相對峰值等指標上是一致的。

2 限制酶的選擇

T-RFLP分析區(qū)分細菌種群的方法，依賴于使用限制性內(nèi)切酶來檢測16S rRNA基因的序列多態(tài)性。通常情況下，那些有四個堿基對識別位點的酶，由于具有較高的識別頻率而被使用。一些研究已經(jīng)證明，使用一個以上的限制性內(nèi)切酶提高了細菌種群的分辨率。這是因為，不同的細菌種群經(jīng)一個特定引物-酶組合處理后，可產(chǎn)生相同的末端限制性長度片段［1］。

檢測不同的限制性內(nèi)切酶對于特定序列的消化能力，可通過基因序列數(shù)據(jù)庫、不同富度種群以及從T-RFs數(shù)據(jù)庫反復隨機抽樣等方法。Engebretson與Moyer［6］評估了18種限制酶后發(fā)現(xiàn)，在他們的模型群落中最常用于剪切單個群落的酶是BstUI，DdeI，Sau961和MspI。對于超過50個操作分類單元(OTUs)的群落，沒有一種限制酶可以作用于OTUs總量的70%以上。因此，T-RFLP能夠有效地用于低或中等豐富度的群落。

評價一種限制性內(nèi)切酶對不同序列的消化能力可借助生物信息學工具來完成，比如T-RFLP分析程序(TAP)TRFLP(http:∥rdp8.cme.msu.edu/html/TAP-trflp.html)、針對16S rRNA基因的MiCA (http:∥mica.ibest.uidaho.edu/)工具以及目的在于功能基因的ARB實現(xiàn)工具TRF-CUT(http:∥www.mpi-marburg.mpg.de/downloads/)等。TAP TRFLP位于RDP網(wǎng)站，它通過運用數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)來進行計算機模擬，以不同的引物-酶組合來消化數(shù)據(jù)庫中所有的16S rRNA基因，從而進行限制酶的選擇。TAP T-RFLP把選擇的一個正向或反向引物相匹配于數(shù)據(jù)庫中的每一個序列后，將所有匹配引物的序列都通過已選擇的選擇限制酶進行計算機模擬消化。這樣的分析可以解決幾個問題:①哪種(些)酶最適用于區(qū)分種系從而進行種群多樣性評估;②哪種(些)酶最適用于識別靶系統(tǒng)基因組;③哪種(些)引物-酶組合最適合一個特定的數(shù)據(jù)集。默認的輸出結(jié)果顯示在RDP的系統(tǒng)層次結(jié)構(gòu)中。此外，這些結(jié)果可以通過序列名稱或末端片段大小進行整理。雖然TAP TRFLP是一個功能強大的工具，對不同的限制性內(nèi)切酶對各種群的分辨能力，可以給研究者以直觀的印象，但也同時具有特殊限制。它只允許一個引物酶組合被指定，數(shù)據(jù)不能自動排序，并且結(jié)果不能被打印或輸出于其他程序。相反，MiCA允許用戶指定正向引物與反向引物，一個引物與目標序列的不匹配數(shù)量，可選擇3個限制酶且可選擇使用數(shù)據(jù)庫。該工具使用連接到數(shù)據(jù)庫的一個查詢程序，并在特定參數(shù)的基礎(chǔ)上對數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果可被寫入PHP、純文本或逗號分隔值格式。然而，這些結(jié)果的缺陷是它們可能會非常大且難以解釋。另外一個可選擇的的工具是限制性內(nèi)切酶選擇器(REPK;http:∥rocaplab.ocean.washington.edu/ tools/repk)，該程序可針對用戶指定的序列，自動確定相關(guān)的的限制酶集。用戶輸入一個修整后的FASTA格式文件，文件包含被用于計算機模擬消化分析的序列。上傳FASTA文件后，可通過最新REBASE數(shù)據(jù)庫得出的列表中來選擇限制酶，或者用戶自行定義來選擇。比如末端片段的最小、最大允許長度和每種酶必須能夠區(qū)分的種群數(shù)目的最小閾值等，諸如此類的指標都可具體設(shè)置。所有選定的限制酶都雙向消化既定序列。末端片段的大小被確定并且產(chǎn)生一個模型。特定大小的酶切片段被置于特定“箱體”中并認為大小相同。然后，程序會決定“箱體”內(nèi)是含有單一細菌種群的序列還是不同種群的序列，不同種群序列意味著該特定的限制酶不能區(qū)分細菌種群。那些能夠充分區(qū)分細菌種群的酶經(jīng)過嚴格篩查并被保存在最終輸出結(jié)果中。Collins與Rocap［7］研究表明，如果一個新的群落必須被區(qū)分，或者一個既定群落的組成成分必須被區(qū)分，那么REPK將會特別適用。

盡管網(wǎng)絡(luò)工具和計算機模擬實驗研究提供了判斷限制酶分辨細菌群落的能力，這些工具產(chǎn)生的結(jié)果仍需謹慎使用。研究人員必須謹記，目前發(fā)現(xiàn)的細菌多樣性只是一小部分而且序列數(shù)據(jù)庫是不完整的。因此，樣品中含有的種系，沒有在任何數(shù)據(jù)庫中表示出來的情況是可能的。因此，計算機模擬消化分析選擇引物-酶組合時應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗評估以確保這些酶能夠更好地區(qū)分樣品種群。

3 末端片段的解析

樣品中熒光標記T-RFs的長度與豐度的差別通常使用毛細管或聚丙烯酰胺凝膠電泳區(qū)分，T-RFs的電泳遷移率與已知標準大小比較。T-RFs的實際大小通過插值算法估計，如Local Southern算法可用于GeneScan和GeneMapper這樣的軟件包。每個TRF的豐度由熒光強度來確定并表示為峰高或峰面積。一般來說，T-RFLP分析采用毛細管電泳會比聚丙烯酰胺凝膠電泳更精確且重現(xiàn)性更好［8］。即便如此，運行間的變化造成即使是相同的細菌種群的末端片段都會存在細小偏差，因此圖譜識別需要保持一致。不同大小的片段一般被分配至不同種類的操作分類單元或“箱”中。每個“箱”中可能實際包含不止一個種系，這由被分析群落的物種復雜性、種群間的親緣關(guān)聯(lián)度以及引物與酶的剪切能力所決定。毛細管系統(tǒng)的一個缺點是，由于采用電動進樣，通過施加電場將帶電分子注入到毛細管中，這會導致越小的分子越先進入，所以應(yīng)將鹽和PCR反應(yīng)［9］或酶切反應(yīng)［10］的引物在樣品分析前去除。

片段大小的精確確定尤為重要，特別是在如果我們的目的是從T-RFLP圖譜推斷出合理的群落組成的前提下。使用網(wǎng)絡(luò)工具可確定合理的群落組成，其中，T-RFs的大小應(yīng)與來自數(shù)據(jù)庫信息中相應(yīng)種群的16S rRNA基因的T-RF大小相匹配。然而有時這點并不能保證做到，因為假的T-RFs(特別是單鏈擴增子)可能在PCR反應(yīng)中形成［11］，并且不同的熒光團可以通過不同方式影響片段的電泳遷移率，使在確定片段大小時產(chǎn)生錯誤［12］。盡管DNA片段的毛細管電泳分析是非常精確的(±1 bp)，但它并不一定是準確的，因為尚存在一些不確定因素。用熒光素染料標記的DNA片段，例如6FAM和HEX，遷移速率比那些用羅丹明染料標記的DNA片段(如ROX)快得多，后者常用于作為系統(tǒng)內(nèi)標。其結(jié)果是，HEX或6FAM標記的末端片段大小會被低估。調(diào)整遷移行為的差異是不容易的，因為片段大小差異的幅度不是恒定的。對于小于100 bp的片段，其差別可達11 bp［13］，對于大約500 bp的片段，其差別又會減少至2～3 bp，而對于大于700 bp的片段，這種差值又會增加。另外，各片段中嘌呤含量的不同也可帶來T-RF真實值和觀察值大小的差異［14］。此外，用于確定DNA片段大小的算法的性能也隨著DNA片段大小的增加而降低。常用的Local Southern算法假定片段的遷移時間隨著片段大小線性增加，但事實并非如此，所以越大的DNA片段就越可能被錯誤認定。目前，沒有任何的解決方案可以糾正由于使用不同熒光造成的遷移差異，研究者在使用T-RFLP數(shù)據(jù)以確定群落組成時應(yīng)該考慮到這一點。

4 從干擾中區(qū)分信號

T-RFLP圖譜分析的第一步是將信號從電子干擾中區(qū)分出來，即需要確定基準線。GeneScan和GeneMapper這樣的程序可以確定峰的開始與結(jié)束、峰的高度及面積等，但必須由研究者確定實際基準。因為不同的運行過程產(chǎn)生不同的電子干擾，所以理想情況下，用來從圖譜的干擾信號中篩查真實信號的程序應(yīng)該是一個自動化的客觀方法。峰高或者峰面積都可以用來從干擾中區(qū)分信號，且兩者具有各自的優(yōu)點和缺點［15］。確定基線的方法目前包括固定閾值、比例閾值以及統(tǒng)計確定閾值等幾種。

區(qū)分信號最簡單的方法是施加一個固定的檢測閾值，即隨機選擇的值，如50或100 FU(熒光單位)。采用高檢測閾值，如100 FU［16］，可確保將峰誤判為干擾的數(shù)目大大減少，但風險在于可能將客觀存在的矮小峰排除在外。此外，設(shè)定固定的檢測閾值的前提，是基于檢測樣本的圖譜是不受負荷與檢測效率等實驗誤差影響的假設(shè)。Dunbar［17］已經(jīng)表明閾值不能被任意預(yù)先設(shè)定，因為最佳閾值在樣本間存在差異。基于此，固定閾值的方法不是一個有效的方法。

一個更精確的方法是使用一個固定的百分比閾值［18］。要做到這一點，需要將一個給定樣品的圖譜中存在的所有的T-RFs及其峰面積生成一個矩陣。如果一個T-RF沒有在一個特定圖譜中出現(xiàn)，會分配至為“零”的區(qū)域。然后，該數(shù)據(jù)集會被圖譜中計算出的每個峰的總面積的比例標準化。要確定基線，百分比閾值會以這樣的方式被選擇，即總峰面積和峰數(shù)之間的相關(guān)性被最小化。之所以這樣做，是因為需要控制由于注入DNA量的不同而帶來的差異?？偡迕娣e和峰數(shù)量間的強相關(guān)性表明，更高的DNA注入量造成了閾值以上的較大數(shù)量的峰，而不是因為樣本中此群落的比重大造成的。

Dunbar介紹的方法也提及了上述問題，注入不同量的DNA可能會影響細菌種群在T-RFLP圖譜表現(xiàn)的數(shù)量和相對豐度。該方法應(yīng)用最小峰高作為基礎(chǔ)來標準化圖譜中的其他峰高。要做到這一點，每個圖譜的總峰高的計算僅包括大于25個熒光單位的峰高。數(shù)據(jù)集中任何樣本的總峰值除以最小峰高值，而得到此峰的校正系數(shù)。此校正系數(shù)被用來調(diào)整圖譜中的峰值高度，并通過這樣做調(diào)整DNA注入量的差異。例如，假設(shè)20 000 FU是最小峰高，則圖譜上總峰高度為40 000 FU的樣品的校正系數(shù)為0.5。因此，后面的圖譜將每個峰值高度乘以0.5。此次修正后，有些峰將低于25 FU的門檻并被去除。隨后計算每個圖譜而得到一個新的總峰高值，并且這個過程反復進行直至它們每個都等于最小峰高。作者指出，使用25 FU的閾值未能從數(shù)據(jù)中消除所有干擾，并且這會影響進一步的統(tǒng)計比較。因此，只有標準化后的峰將會做進一步的比較。這種方法是在恒定基線值(25 U)主觀選擇中優(yōu)化的方案。

不同的圖譜中的電子干擾是不同的，所以使用相同的百分比閾值以消除所有圖譜中干擾是不可能的。因此，Osborne［16］提出使用可變百分比閾值來解決這一問題。Sait［18］及Osborne等的方法試圖最小化總峰面積與峰數(shù)之間的關(guān)系。在該方法中，分別為每個圖譜確定閾值百分比使之達到最弱的總峰面積與峰數(shù)之間關(guān)系的結(jié)果。Osborne將他們的方法與Sait和Dunbar的兩個程序作比較并總結(jié)，他們的方法能更好地區(qū)分信號與干擾，因為加工后的圖譜能夠最大程度地精確分組。

統(tǒng)計理論的一種新的統(tǒng)計方法已應(yīng)用到信號/干擾區(qū)分中［19］。使用此程序，數(shù)據(jù)由每個峰的面積除以該特定樣品的總的峰面積而標準化。數(shù)據(jù)集的標準偏差隨后通過假定真實平均值為零而計算出來。峰面積大于平均值的標準偏差3倍的峰被確定為真實信號并被采用。這個過程一直重復直至沒有更多的“真實峰”被確定。這種方法倚重于為解決注入DNA不同而采取的圖形標準化，而這種標準化導致了一些無法與干擾相區(qū)分的小峰的減少。盡管如此，此方法在識別較小的峰時比其他方法更加靈敏，這也可能會導致圖譜中各菌群豐度的細微差別。盡管使用基于峰高和峰面積的歐幾里德距離可以將這些差異縮小，但基于存在/不存在的矩陣分析可能會放大豐度的差異并可能會產(chǎn)生不準確的結(jié)果。

5 圖譜的整理與分析

T-RFLP分析不同運行過程中的差異，可能導致對相同菌群的T-RF估計片段大小產(chǎn)生細微差別。因為這種運行間的變化是客觀存在的，所以在進行進一步的統(tǒng)計分析之前，必須使圖譜保持有效的一致性。用于將不同大小的片段分配給不同的長度分型區(qū)(箱體)的方法，包括四舍五入法、人工分區(qū)以及基于聚類的統(tǒng)計方法［20］。如果參數(shù)的選擇是基于貫穿始終的實驗數(shù)據(jù)，則可以應(yīng)用自動化程序?qū)Υ髷?shù)據(jù)集進行客觀分析，并提供統(tǒng)計學依據(jù)，因此，統(tǒng)計方法的使用無疑優(yōu)于四舍五入及人工分區(qū)的方法。

四舍五入是最簡單的方法。預(yù)計的片段大小被四舍五入至最接近整數(shù)，然后每個整數(shù)倍視為一個箱。這個方法存在局限性，DNA片段的毛細管電泳分析的誤差為±0.5 bp，所以分次運行的相同片段可能被放置于不同的箱中。例如，一個圖譜中100.4 bp的片段將被放置于一個100 bp的箱中，而在另一圖譜中的該片段可能被測出為100.6 bp，四舍五入后為101 bp并被置于另一個箱中。由于兩個片段大小的差異只有0.2 bp，在分組時它們可能本該歸于同一類。由于有此問題，對于調(diào)整T-RFLP圖譜來說，整數(shù)法并不適用。

與四舍五入法比較，用人工分區(qū)的方法，一個有經(jīng)驗的分析師可在兩可的情況下做出正確的選擇。人工分區(qū)由于存在主觀判斷誤差的可能性，并且不具備高通量分析能力，因此并不推薦。

Hewson和Fuhrman［21］描述了一個箱體化的技術(shù)，其特征在于圖譜基于固定大小窗口的不同箱體而對齊。在他們的例子中，Hewson和Fuhrman使用10 bp大小作為箱的窗口。如果排除由于引物二聚體峰產(chǎn)生的大小小于50 bp的片段，則第一個箱將包含50～59 bp的所有片段，第二個箱將包含所有大小為60～69的片段，并依此類推。排列進行數(shù)輪，且每輪中窗口的起點都要偏移1 bp;即在第二輪排列中，所有片段長度，從51～60 bp，61～70 bp等，被認為是相同的。完成對齊所需要的次數(shù)等于箱的窗口的大小，在本例中，需要十次(應(yīng)當指出，此方法被發(fā)展用于使用聚丙烯酰胺凝膠和非毛細管凝膠電泳的片段分析中，由于可能產(chǎn)生較大的運行間差異，因此，提倡使用大的窗口)。對于每一層結(jié)構(gòu)，所有的圖譜的兩兩之間的相似性被計算，在圖譜中兩兩之間的最大相似中構(gòu)建聚類樹(UPGMA)，該樹對不同的微生物群落進行勾畫。分箱方法只在對未知群落結(jié)構(gòu)的樣本檢測，因此，這種方法用于確定真實的微生物群落的差異的能力仍然未知。這種分箱方法經(jīng)Ruan［22］進一步改進后，允許根據(jù)片段大小決定不同箱體的窗口大小，因為片段測量的可重復性隨片段大小的變化而變化。

Dunbar［17］提出根據(jù)片段大小來對齊圖譜，例如±0.5 bp。由于這種分析使用毛細管凝膠電泳，所有長度差異小于0.5 bp的片段被認為是相同的并置于同一箱中。這種方法的一個潛在缺陷是，在某些情況下，尺寸差小于0.5 bp的峰可能是客觀存在的。為了解決這個問題，Dunbar限制了可以被分配給一個箱對應(yīng)圖譜的峰的最大數(shù)目。此方法優(yōu)于Hewson和Fuhrman開發(fā)的方法，因為通過Dunbar的方法，決定兩個片段是否屬于同一箱體的基礎(chǔ)是兩個片段大小的差異，而不是它們是否屬于一個相同的預(yù)設(shè)的固定箱的窗口。

Abdo［19］在分析T-RFLP圖譜時使用層次聚類的方法。盡管對箱中片段的數(shù)目沒有限制，這種方法仍然與Dunbar描述的方法相似。首先，所有相關(guān)的圖譜中的所有片段長度被合并、排序以及刪除重復片段。然后，采用聚類樹(UPGMA)進行層次聚類，以識別足夠接近且可被同一箱體化(例如，±1 bp半徑內(nèi))的長度片段。聚類程序通過選擇兩個具有最小尺寸差異的片段啟動。將這兩個片段進行分組，并形成一個由它們的平均片段大小表示的箱。此程序持續(xù)將片段分組至箱，直至沒有更多的片段或箱能夠滿足尺寸差小于定義值的要求。如果一個樣本內(nèi)的片段分在同一箱體，則它們的峰面積相加并視為一個單一的峰。

分析環(huán)境中微生物的差別，為法庭科學實踐提供有效技術(shù)手段和解決思路已成為不爭的趨勢［23］。盡管T-RFLP技術(shù)目前還存在一些缺陷，但仍是最好的微生物多樣性分析工具之一。我們相信，隨著該方法的進一步完善和設(shè)備、試劑的改進，數(shù)據(jù)庫中核酸序列的不斷豐富，以及相關(guān)標準的制定和實施，TRFLP技術(shù)在司法實踐中必將得到更加廣泛的應(yīng)用。

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(責任編輯 陳小明)

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本文系吉林省科技廳科技發(fā)展計劃項目階段性研究成果(20110424)。

陳尚坤(1969—)，女，吉林長春人，吉林警察學院學報編輯部主任，編審。主要研究方向為微量物證鑒定。